食品中常見病原菌快速檢測系統(tǒng)研究——裸磁珠制備及TaqMan實時熒光PCR快速檢測芽胞桿菌Ⅰ群大細(xì)胞群.pdf

1、目的：建立以磁分離技術(shù)為核心的分離系統(tǒng)，摸索制備具有非特異吸附性能的裸磁珠及其包被的條件，為下一階段免疫磁珠的制備奠定基礎(chǔ)。同時建立以蠟樣芽胞桿菌為代表的芽胞桿菌I群大細(xì)胞群細(xì)菌的TaqMan實時熒光PCR快速檢測方法，并對該方法進(jìn)行了初步的優(yōu)化、評價及應(yīng)用。 方法： 本研究分為兩部分內(nèi)容： 1.裸磁珠的制備及包被 1.1磁珠的制備 Fe<'2+>和Fe<'3+>分別與OH離子反應(yīng)生成Fe(OH)

2、<,2>和Fe(OH)<,3>，F(xiàn)e(OH)<,2>和Fe(OH)3不穩(wěn)定，分別降解生成FeO和Fe<,2>O<,3>，即最后生成了Fe<,3>O<,4>。用蒸餾水洗滌磁珠至中性，并用磁分離架進(jìn)行分離。 1.2磁珠的包被 以1％的醋酸溶解殼聚糖，將殼聚糖包被于制備好的裸磁珠表面后，進(jìn)而再包被上作為交聯(lián)劑的戊二醛。 2.TaqMan實時熒光PCR快速檢測芽胞桿菌I群大細(xì)胞群細(xì)菌方法的建立 通過比較大量芽胞桿

3、菌I群大細(xì)胞群細(xì)菌的特異性基因，最終選擇ITs基因作為檢測的目的片段。從Gen/Bank中下載ITS基因序列并進(jìn)行同源性比較，選擇保守區(qū)段進(jìn)行引物和探針的設(shè)計。對比CTAB法和硅膠模型基因組DNA提取法兩種DNA提取方法，選取實時熒光PCR快速檢測方法建立初期，合適的DNA標(biāo)準(zhǔn)制備方法。同時，通過優(yōu)化引物濃度、退火溫度、探針濃度、Mg<'2+>濃度、dNTPs濃度、Taq酶濃度以及緩沖液濃度，以建立起TaqMan實時熒光PCR快速檢測芽

4、胞桿菌I群大細(xì)胞群細(xì)菌的方法。最后，檢驗該方法的靈敏度和特異性，并對模擬樣品進(jìn)行了檢測。 結(jié)果： 1.磁珠的制備和包被 成功制備出裸磁珠，經(jīng)透射電鏡觀察，裸磁珠直徑達(dá)到納米級，制備的磁珠在溶液中懸浮性較好，在磁場的作用下可較好的分離該磁性微粒。殼聚糖溶解于1％醋酸后用于包被制備的磁珠，包被磁珠體積增大，可用于連接抗體，為后續(xù)免疫磁珠的制備奠定了基礎(chǔ)。 2.選取16S-23S rDNA基因間區(qū)序列作為目的基

5、因設(shè)計引物和探針如下：上游引物：5’-GAGTCCATTIAGGCCCACCATIAC-3'下游引物：5’-AGCTTGGCGACTGGAGGACGC-3'TaqMan探針：5’-FAM-CAAGGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAG-TAMRA-3’ 經(jīng)過優(yōu)化，成功建立了以蠟樣芽胞桿菌為代表的芽胞桿菌I群大細(xì)胞群TaqMan實時熒光PCR的快速檢測方法，優(yōu)化后的反應(yīng)體系如下表所示。并通過比較，最終選取硅膠模型基因組DNA提

6、取法，成功制備了該檢測方法的DNA初標(biāo)準(zhǔn)。同時該方法的評測結(jié)果顯示，該方法的檢測靈敏度達(dá)到172fg，菌液靈敏度達(dá)到22cfu/反應(yīng)體系；且該方法特異性較好，可同時檢測包括蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、覃狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌在內(nèi)的4種芽胞桿菌I群大細(xì)胞群細(xì)菌。 本研究為建立常見食源性病原菌快速檢測系統(tǒng)，在分離手段上成功制備了納米級的裸磁珠和包被磁珠，為下一步免疫磁珠的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。同時，成功建立了芽胞桿菌I群大細(xì)胞群