病原弧菌免疫磁珠捕獲——多重PCR快速檢測(cè)的建立.pdf

1、病原性海洋弧菌是重要的食源性病原菌，引起食物中毒危害，同時(shí)也是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的主要病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)弧菌快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，能夠有效的監(jiān)測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的病原弧菌及減少食品安全事故的發(fā)生，同時(shí)也是防御和治療的關(guān)鍵；因此對(duì)弧菌快速檢測(cè)方法的研究有重要的意義。本研究以弧菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins，Omps)OmpU作為免疫磁珠分離的靶標(biāo)，建立對(duì)多種典型病原弧菌同步檢測(cè)的免疫磁珠捕獲-P

2、CR快速檢測(cè)體系。所獲的研究結(jié)果如下：
　　首先通過(guò)基因克隆方法，分別擴(kuò)增得到副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnifgicus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、擬態(tài)弧菌(V. mimicus)外膜蛋白OmpU對(duì)應(yīng)編碼基因，進(jìn)一步對(duì)弧菌OmpU進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其在弧菌中具有很好的保守性，存在多個(gè)共同抗原表位，推測(cè)OmpU在弧菌中具有交叉免疫原性，可以作為弧菌免疫

3、分離的靶標(biāo)。以原核表達(dá)載體pET-32a(+)為基礎(chǔ)，分別構(gòu)建獲得4種弧菌來(lái)源的OmpU的異源表達(dá)重組工程菌，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化及驗(yàn)證。
　　其次，以純化的4種弧菌的重組外膜蛋白OmpU作為抗原免疫大白兔，制備多克隆抗血清。進(jìn)一步用Western-blotting和Whole cell ELISA分析OmpU在弧菌種內(nèi)及種間的交叉免疫原性，結(jié)果顯示OmpU抗血清能與弧菌產(chǎn)生種內(nèi)、種間的交叉反應(yīng)，與非弧菌細(xì)菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生較弱的

4、反應(yīng)，表明弧菌OmpU存在共同的抗原表位，是一種表面交叉抗原；同時(shí)Who le ce ll ELISA還可以進(jìn)一步證實(shí)O mp U抗血清能夠識(shí)結(jié)合弧菌。綜合說(shuō)明弧菌OmpU是一種交叉抗原，可以作為免疫磁珠分離的靶標(biāo)，其抗血清可以用來(lái)制備免疫磁珠分離弧菌。
　　接著，以O(shè)mpU抗血清與磁珠偶聯(lián)制備OmpU免疫磁珠，dnaJ作為PCR檢測(cè)引物，研究建立弧菌免疫磁珠捕獲-PCR檢測(cè)體系。為了研究檢測(cè)體系對(duì)弧菌的檢測(cè)效果，以創(chuàng)傷弧菌來(lái)源的

5、OmpU抗血清制備免疫磁珠對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行種內(nèi)捕獲PCR檢測(cè)，對(duì)擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌進(jìn)行種間捕獲 PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)3株創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)靈敏度都達(dá)到101 CFU/mL，對(duì)擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌的種間檢測(cè)為106CFU/mL，推測(cè)OmpU免疫磁珠建立的檢測(cè)體系在種內(nèi)具有很好的檢測(cè)效果。進(jìn)一步以副溶血弧菌來(lái)源的OmpU抗血清建立免疫磁珠捕獲-PCR對(duì)4株副溶血弧菌進(jìn)行種內(nèi)檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度都達(dá)到101 CFU/mL，由此說(shuō)明O mp U免疫

6、磁珠建立的檢測(cè)體系在種內(nèi)具有很好的檢測(cè)效果。
　　隨后，以副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌來(lái)源的OmpU抗血清分別與磁珠偶聯(lián)制備成不同的OmpU免疫磁珠，向含2-3種混合弧菌的檢測(cè)樣本中添加對(duì)應(yīng)的免疫磁珠，研究建立實(shí)現(xiàn)對(duì)2種或是3種弧菌的同步檢測(cè)體系。在對(duì)創(chuàng)傷弧菌+擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌+擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌+副溶血弧菌進(jìn)行的免疫磁珠捕獲-雙重PCR檢測(cè)，及對(duì)霍亂弧菌+擬態(tài)弧菌+副溶血弧菌進(jìn)行的免疫磁珠捕獲-三重PCR檢測(cè)，都能