經(jīng)VEGF-,165-基因修飾后的脂肪組織來源的干細胞治療糖尿病性勃起功能障礙大鼠的實驗研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，糖尿病(Diabetes mellitus,DM)為代表的代謝性疾病患病率逐年上升，男性糖尿病患者并發(fā)勃起功能障礙的發(fā)病率約三倍于普通人群1-14，并且比普通人群要早10～15年發(fā)病，針對其發(fā)病機制及防治的研究十分有必要，因此我們通過建立DMED大鼠模型研究陰莖海綿體組織內(nèi)VEGF系統(tǒng)功能的變化，再構(gòu)建慢病毒-VEGF165載體后轉(zhuǎn)染入脂肪組織來源的干細胞(ADSCs)作為治療DMED的種子細胞進行細胞移植入DMED

2、大鼠體內(nèi)觀察其療效。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的建立及陰莖海綿體組織內(nèi)VEGF系統(tǒng)的變化。
　　 目的：探討鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立糖尿病勃起功能障礙動物模型的可行性，以及測定陰莖海綿體組織內(nèi)VEGF系統(tǒng)功能的變化。
　　 方法：實驗組SD雄性大鼠分三組(組1、2、3)，分別腹腔注射35mg/kg、40mg/kg、60mg/kg的STZ；正常對照組。大鼠腹腔注射檸

3、檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。4d后，快速法測定血糖；10周后，應用阿樸嗎啡(APO)100μg/kg皮下注射觀察大鼠陰莖勃起情況并篩選ED模型，并分別測定實驗各組及正常對照組大鼠平均頸動脈內(nèi)壓(MAP)、陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)，并收集陰莖組織進行免疫組化及Western Blot分析其VEGF系統(tǒng)功能。
　　 結(jié)果：實驗組中組1糖尿病成模率為87.5％(35/40)，組2和組3成模率均為100％，但組3有17.5％(7/40)的死亡

4、率。實驗組血糖明顯高于對照組(P＜0.01)，體重、陰莖勃起次數(shù)、陽性勃起率及刺激海綿體神經(jīng)后的ICP值則明顯低于正常組(P＜0.01)，實驗組間(組1、2、3間)則無明顯差異；MAP值在各組間無明顯差異。DMED大鼠陰莖海綿體VEGF系統(tǒng)(VEGF，F(xiàn)lk-1，eNOS)免疫組化及WesternBlot分析均明顯下降。
　　 結(jié)論：腹腔注射STZ誘導糖尿病大鼠最佳注射劑量為40mg/kg，注射STZ后出現(xiàn)典型的糖尿病臨床癥狀，

5、血糖明顯增高，ICP下降，勃起功能明顯受損，APO篩選試驗可有效篩選ED模型。DMED大鼠陰莖海綿體VEGF系統(tǒng)功能異常，為后續(xù)研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 第二部份：慢病毒-VEGF165載體的構(gòu)建以及其在脂肪組織來源的干細胞中的表達。
　　 目的：目前，干細胞已成為基因治療載體的最佳選擇，但是對于脂肪干細胞的相關(guān)研究還很少，因此我們打算構(gòu)建過表達VEGF165的慢病毒載體并對脂肪組織來源干細胞進行感染以期得到用于基因治

6、療的種子細胞。
　　 方法：通過PCR方法將EHS1001-68950485313912克隆突變成VEGF165(NM_001025368)轉(zhuǎn)錄本片段。過表達慢病毒采用三質(zhì)粒系統(tǒng)(pGC-FU、pHelp1.0和pHelp2.0)進行包裝。進行滴度測定后使用構(gòu)建成功的載體對ADSCs進行感染。通過免疫熒光、western blot和ELISA分析鑒定VEGF165在ADSCs中的表達。
　　 結(jié)果：DNA測序和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2

7、93T細胞表達檢測證明VEGF165與GFP被成功的構(gòu)建為融合表達載體。經(jīng)定時定量PCR檢測，得到的病毒滴度達到2×108TU/ml。用過表達VEGF165的慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪組織來源干細胞，western blot、ELISA和免疫熒光檢測表明基因穩(wěn)定表達。
　　 結(jié)論：本研究通過獲得穩(wěn)定表達VEGF165的脂肪組織來源干細胞為糖尿病性勃起障礙的治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分：經(jīng)VEGF165基因修飾后的脂肪組織來源的干

8、細胞治療糖尿病性勃起功能障礙大鼠。
　　 目的：探討經(jīng)VEGF165基因修飾后的ADSCs治療DMED大鼠的有效性。
　　 方法：將實驗動物分為五組：A、正常對照組；B、空白(陰性)對照組；C、慢病毒-VEGF165治療組；D、空白ADSCs治療組；E、VEGF165-ADSCs治療組。注射后在不同時間段7天和28天行大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓和平均頸動脈壓的測定，測壓后取其陰莖組織做免疫組化及Western Blot分析。