shRNA抑制豬傳染性胃腸炎病毒在PK-15細(xì)胞中增殖的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病，以脫水、腹瀉和嘔吐為臨床癥狀。任何年齡和品種的豬都可感染，尤其是2周齡以內(nèi)仔豬，給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。常規(guī)藥物針對(duì)TGE沒(méi)有明顯的治療效果，雖然通過(guò)疫苗接種和屠宰感染豬在一定程度上能控制

2、TGE的流行，但免疫失敗時(shí)有發(fā)生。因此有必要探索新的抗病毒方法來(lái)對(duì)該病進(jìn)行防控。RNA干擾是一種由雙鏈小RNA介導(dǎo)的以序列特異性方式誘導(dǎo)同源mRNA降解的基因沉默機(jī)制。由于RNAi技術(shù)能夠特異性阻斷特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)被認(rèn)為是抗病毒感染的最有效方法之一。
　　TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬、基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長(zhǎng)約2.86×104bp，主要包括4種結(jié)構(gòu)蛋白。M基因在TGEV形態(tài)發(fā)生過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，本文根據(jù)T

3、GEVM基因的結(jié)構(gòu)序列和短發(fā)卡RNA（shRNA）序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)shRNA序列，構(gòu)建成RNA干擾載體。將重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下導(dǎo)入豬腎細(xì)胞（PK-15），接種TGEV后，分別從病毒感染滴度、基因表達(dá)產(chǎn)物和病毒基因組RNA復(fù)制水平三個(gè)方面研究特異性shRNA對(duì)TGEV在PK-15中增殖的影響。
　　主要結(jié)果如下：
　　1.從TGEV CQ毒株中擴(kuò)增M基因并獲得核苷酸序列，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明不同分離株的M基

4、因高度保守，與南京SHXB株親緣關(guān)系最近，屬于同一分支，M蛋白存在信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)在16-17位氨基酸之間，存在3個(gè)跨膜區(qū)，是以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主的蛋白。
　　2.分別設(shè)計(jì)了靶向TGEV CQ株M基因103~121位、358~376位和625~643位mRNA的編碼shRNA的單鏈核苷酸，經(jīng)退火后形成編碼shRNA的雙鏈DNA，將其分別與表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo連接，成功獲得重組干擾質(zhì)粒載體pRNAT-1、pRNA

5、T-2和pRNAT-3。PK-15細(xì)胞培養(yǎng)到50-70％融合時(shí)，對(duì)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染不同的干擾質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染24h后進(jìn)行熒光觀察確認(rèn)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
　　3.PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體后培養(yǎng)24h，接種1×103 TCID50 TGEV繼續(xù)培養(yǎng)48h后，通過(guò)CPE、TCID50、IFA和Real time RT-PCR分析TGEV在PK-15細(xì)胞中的增殖情況。CPE分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照孔在接種TGEV48h后，大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)

6、胞病變，pRNAT-1細(xì)胞的病變程度也較重，相比之下，干擾質(zhì)粒pRNAT-2和pRNAT-3能減輕TGEV在PK-15細(xì)胞上引起的特異性病變。IFA和TCID50結(jié)果進(jìn)一步表明，pRNAT-2和pRNAT-3干擾質(zhì)粒能在蛋白水平上有效抑制病毒的增殖。此外，Real time RT-PCR結(jié)果顯示3個(gè)干擾質(zhì)粒pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3在mRNA水平上抑制效率分別為13%，68%和70%，表明3個(gè)干擾質(zhì)粒在不同程度上能抑

7、制病毒基因組的復(fù)制，其中完全靶向M基因保守結(jié)構(gòu)域的pRNAT-2和pRNAT-3干擾質(zhì)粒抑制效果好于干擾質(zhì)粒pRNAT-1。
　　總之，通過(guò)RNAi途徑在細(xì)胞水平上研究TGEV M基因功能和復(fù)制的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)靶向TGEVM基因358~376位和625~643位的siRNA能在mRNA和蛋白水平有效抑制TGEV的復(fù)制，保護(hù)PK-15細(xì)胞抵御TGEV CQ株引起的細(xì)胞病變。這能為后期篩選特定分子抑制劑提供靶標(biāo)位點(diǎn)以及為新型藥物的研制提供