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文檔簡(jiǎn)介
1、豬傳染性胃腸炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病,以脫水、腹瀉和嘔吐為臨床癥狀。任何年齡和品種的豬都可感染,尤其是2周齡以內(nèi)仔豬,給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。常規(guī)藥物針對(duì)TGE沒(méi)有明顯的治療效果,雖然通過(guò)疫苗接種和屠宰感染豬在一定程度上能控制
2、TGE的流行,但免疫失敗時(shí)有發(fā)生。因此有必要探索新的抗病毒方法來(lái)對(duì)該病進(jìn)行防控。RNA干擾是一種由雙鏈小RNA介導(dǎo)的以序列特異性方式誘導(dǎo)同源mRNA降解的基因沉默機(jī)制。由于RNAi技術(shù)能夠特異性阻斷特定基因的表達(dá),所以該技術(shù)被認(rèn)為是抗病毒感染的最有效方法之一。
TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬、基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA,長(zhǎng)約2.86×104bp,主要包括4種結(jié)構(gòu)蛋白。M基因在TGEV形態(tài)發(fā)生過(guò)程中具有關(guān)鍵作用,本文根據(jù)T
3、GEVM基因的結(jié)構(gòu)序列和短發(fā)卡RNA(shRNA)序列設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)shRNA序列,構(gòu)建成RNA干擾載體。將重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下導(dǎo)入豬腎細(xì)胞(PK-15),接種TGEV后,分別從病毒感染滴度、基因表達(dá)產(chǎn)物和病毒基因組RNA復(fù)制水平三個(gè)方面研究特異性shRNA對(duì)TGEV在PK-15中增殖的影響。
主要結(jié)果如下:
1.從TGEV CQ毒株中擴(kuò)增M基因并獲得核苷酸序列,生物信息學(xué)分析結(jié)果表明不同分離株的M基
4、因高度保守,與南京SHXB株親緣關(guān)系最近,屬于同一分支,M蛋白存在信號(hào)肽,剪切位點(diǎn)在16-17位氨基酸之間,存在3個(gè)跨膜區(qū),是以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主的蛋白。
2.分別設(shè)計(jì)了靶向TGEV CQ株M基因103~121位、358~376位和625~643位mRNA的編碼shRNA的單鏈核苷酸,經(jīng)退火后形成編碼shRNA的雙鏈DNA,將其分別與表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo連接,成功獲得重組干擾質(zhì)粒載體pRNAT-1、pRNA
5、T-2和pRNAT-3。PK-15細(xì)胞培養(yǎng)到50-70%融合時(shí),對(duì)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染不同的干擾質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染24h后進(jìn)行熒光觀察確認(rèn)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
3.PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體后培養(yǎng)24h,接種1×103 TCID50 TGEV繼續(xù)培養(yǎng)48h后,通過(guò)CPE、TCID50、IFA和Real time RT-PCR分析TGEV在PK-15細(xì)胞中的增殖情況。CPE分析發(fā)現(xiàn),對(duì)照孔在接種TGEV48h后,大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)
6、胞病變,pRNAT-1細(xì)胞的病變程度也較重,相比之下,干擾質(zhì)粒pRNAT-2和pRNAT-3能減輕TGEV在PK-15細(xì)胞上引起的特異性病變。IFA和TCID50結(jié)果進(jìn)一步表明,pRNAT-2和pRNAT-3干擾質(zhì)粒能在蛋白水平上有效抑制病毒的增殖。此外,Real time RT-PCR結(jié)果顯示3個(gè)干擾質(zhì)粒pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3在mRNA水平上抑制效率分別為13%,68%和70%,表明3個(gè)干擾質(zhì)粒在不同程度上能抑
7、制病毒基因組的復(fù)制,其中完全靶向M基因保守結(jié)構(gòu)域的pRNAT-2和pRNAT-3干擾質(zhì)粒抑制效果好于干擾質(zhì)粒pRNAT-1。
總之,通過(guò)RNAi途徑在細(xì)胞水平上研究TGEV M基因功能和復(fù)制的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)靶向TGEVM基因358~376位和625~643位的siRNA能在mRNA和蛋白水平有效抑制TGEV的復(fù)制,保護(hù)PK-15細(xì)胞抵御TGEV CQ株引起的細(xì)胞病變。這能為后期篩選特定分子抑制劑提供靶標(biāo)位點(diǎn)以及為新型藥物的研制提供
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