新型小分子免疫抑制劑艾拉莫德對(duì)人類樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟的影響.pdf

1、 目的：艾拉莫德(iguratimod,T-614) 是用于治療成人活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的1類新藥。前期功能研究提示它能抑制IFN-γ、IL-1、IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子,免疫球蛋白(IgM 、IgG )的產(chǎn)生并選擇性抑制COX-2,可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制和降低炎癥反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)能啟動(dòng)初始免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)免疫耐受,是治療自身免疫性疾病的重要突破口。國(guó)內(nèi)外暫未見(jiàn)艾拉莫德對(duì)DCs的功能

2、的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在探討艾拉莫德對(duì)健康人外周血DCs的分化和成熟的影響。
方法：本課題采用密度梯度離心法(區(qū)帶離心法)和貼壁法建立人類外周血單核細(xì)胞分化的DCs體外培養(yǎng)體系,采用噻唑藍(lán)比色(MTT)法檢測(cè)艾拉莫德不同濃度作用后對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的存活率的影響,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定艾拉莫德作用后樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的表達(dá)。應(yīng)用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的方法檢測(cè)受艾拉莫德作用后的樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激增殖能力。進(jìn)一步檢測(cè)艾拉莫德對(duì)DCs

3、分泌細(xì)胞因子IL-12的影響,驗(yàn)證艾拉莫德對(duì)DCs功能的作用。
結(jié)果：
1. 倒置相差顯微鏡下觀察樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài),iDCs大部分貼壁,表面突起較少細(xì)胞多呈現(xiàn)較小的圓形,可見(jiàn)大部分的細(xì)胞聚集貼壁。脂多糖刺激24h后再觀察,細(xì)胞體積增大呈圓形或橢圓形,表面可見(jiàn)許多不規(guī)則樹(shù)突狀突起,大部分懸浮為典型的mDC形態(tài)。經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),iDCs表面低表達(dá)CD86和CD83, CD86 陽(yáng)性數(shù)占10.7%、CD83占17

4、.2%,而高表達(dá)HLA-DR和CD80, HLA-DR陽(yáng)性數(shù)占89.8%、CD80 92.1%,經(jīng)LPS刺激24h后,iDCs向mDC發(fā)展, CD86陽(yáng)性數(shù)占為78.7%、CD83占84.7%,較未成熟細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增高。
2.不同濃度艾拉莫德(50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/、250ug/ml)作用于DCs細(xì)胞,經(jīng)MTT法檢測(cè)DCs的存活率>80%。隨著艾拉莫德濃度的增加作用于 DC

5、s,觀察其形態(tài)與正常對(duì)照組相比,體積變小更圓,貼壁細(xì)胞增多,表面的樹(shù)突較少,表明實(shí)驗(yàn)濃度作用下樹(shù)突狀細(xì)胞呈非成熟狀態(tài)。艾拉莫德的濃度在200ug/ml、250ug/ml時(shí)作用于iDCs ≥3h,再予 LPS刺激細(xì)胞成熟,流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子, CD86 陽(yáng)性數(shù)占 19.3%與16.0%,較正常成熟細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)明顯下降。與其他濃度組CD86的陽(yáng)性數(shù)有顯著性差異,與其他表面分子的陽(yáng)性數(shù)也有顯著性差異。
3.艾拉莫德

6、濃度為50ug/ml作用于樹(shù)突狀細(xì)胞,3h后LPS刺激細(xì)胞成熟,再與同種異體淋巴細(xì)胞1：1混合培養(yǎng),其OD值最大為0.6536。同種試驗(yàn)方法,各個(gè)濃度組間、比例組間分別有極顯著差異(p<0.01)。不同濃度艾拉莫德作用于DCs后,在濃度為250ug/ml時(shí)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12的表達(dá)量最低,為5.7pg/ml,在濃度為50ug/ml時(shí)最高,為222.3pg/ml。
結(jié)論：
1. 艾拉莫德能夠劑量依賴性的改變