新型小分子免疫抑制劑艾拉莫德對人類樹突狀細胞分化成熟的影響.pdf

1、 目的：艾拉莫德(iguratimod,T-614) 是用于治療成人活動性類風濕關節(jié)炎的1類新藥。前期功能研究提示它能抑制IFN-γ、IL-1、IL-6、TNF-a等細胞因子,免疫球蛋白(IgM 、IgG )的產(chǎn)生并選擇性抑制COX-2,可能通過NF-κB信號通路抑制和降低炎癥反應。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)能啟動初始免疫應答、誘導免疫耐受,是治療自身免疫性疾病的重要突破口。國內(nèi)外暫未見艾拉莫德對DCs的功能

2、的研究。本實驗旨在探討艾拉莫德對健康人外周血DCs的分化和成熟的影響。
方法：本課題采用密度梯度離心法(區(qū)帶離心法)和貼壁法建立人類外周血單核細胞分化的DCs體外培養(yǎng)體系,采用噻唑藍比色(MTT)法檢測艾拉莫德不同濃度作用后對樹突狀細胞的存活率的影響,流式細胞術測定艾拉莫德作用后樹突狀細胞表面分子的表達。應用混合淋巴細胞反應(MLR)的方法檢測受艾拉莫德作用后的樹突狀細胞對淋巴細胞的刺激增殖能力。進一步檢測艾拉莫德對DCs

3、分泌細胞因子IL-12的影響,驗證艾拉莫德對DCs功能的作用。
結果：
1. 倒置相差顯微鏡下觀察樹突狀細胞的形態(tài),iDCs大部分貼壁,表面突起較少細胞多呈現(xiàn)較小的圓形,可見大部分的細胞聚集貼壁。脂多糖刺激24h后再觀察,細胞體積增大呈圓形或橢圓形,表面可見許多不規(guī)則樹突狀突起,大部分懸浮為典型的mDC形態(tài)。經(jīng)流式細胞學檢測,iDCs表面低表達CD86和CD83, CD86 陽性數(shù)占10.7%、CD83占17

4、.2%,而高表達HLA-DR和CD80, HLA-DR陽性數(shù)占89.8%、CD80 92.1%,經(jīng)LPS刺激24h后,iDCs向mDC發(fā)展, CD86陽性數(shù)占為78.7%、CD83占84.7%,較未成熟細胞的陽性細胞數(shù)明顯增高。
2.不同濃度艾拉莫德(50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/、250ug/ml)作用于DCs細胞,經(jīng)MTT法檢測DCs的存活率>80%。隨著艾拉莫德濃度的增加作用于 DC

5、s,觀察其形態(tài)與正常對照組相比,體積變小更圓,貼壁細胞增多,表面的樹突較少,表明實驗濃度作用下樹突狀細胞呈非成熟狀態(tài)。艾拉莫德的濃度在200ug/ml、250ug/ml時作用于iDCs ≥3h,再予 LPS刺激細胞成熟,流式細胞儀檢測樹突狀細胞表面分子, CD86 陽性數(shù)占 19.3%與16.0%,較正常成熟細胞的陽性數(shù)明顯下降。與其他濃度組CD86的陽性數(shù)有顯著性差異,與其他表面分子的陽性數(shù)也有顯著性差異。
3.艾拉莫德

6、濃度為50ug/ml作用于樹突狀細胞,3h后LPS刺激細胞成熟,再與同種異體淋巴細胞1：1混合培養(yǎng),其OD值最大為0.6536。同種試驗方法,各個濃度組間、比例組間分別有極顯著差異(p<0.01)。不同濃度艾拉莫德作用于DCs后,在濃度為250ug/ml時樹突狀細胞分泌IL-12的表達量最低,為5.7pg/ml,在濃度為50ug/ml時最高,為222.3pg/ml。
結論：
1. 艾拉莫德能夠劑量依賴性的改變