重組載脂蛋白的A-I及其半胱氨酸突變體的功能研究.pdf

1、第一部分：重組載脂蛋白A-I半胱氨酸突變體N74C對(duì)apoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈套環(huán)誘導(dǎo)斑塊和血管重塑的抑制作用
　　 大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查表明血漿高密度脂蛋白(HDL)及其主要蛋白成分-載脂蛋白A-I(apoA-I)的含量與冠脈疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，是冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化(As)最為重要的保護(hù)因素之一。成熟型apoA-I最顯著的特征是含有8個(gè)22個(gè)氨基酸和2個(gè)11個(gè)氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列之間被脯氨酸隔開(kāi)。Apo

2、A-I的天然半胱氨酸突變體apoA-IMilan。(apoA-IM)和apoA-IPari。均表現(xiàn)出增強(qiáng)的心血管保護(hù)活性。ApoA-IM和apoA-IPui。突變位點(diǎn)分別位于螺旋6和螺旋5的雙性α螺旋親-疏水性交界面上，突變位點(diǎn)在多肽鏈位置上恰好相隔22個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)突變發(fā)生的特殊位置，我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并構(gòu)建了七種半胱氨酸突變體：A-I(S52C)，A-I(N74C),A-I(K107C),A-I(G129C),A-I(R173C),

3、A-I(K195C)及A-I(S228C),并對(duì)其單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、脂質(zhì)結(jié)合能力、體外抗氧化和促膽固醇流出等功能進(jìn)行了研究。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥小鼠動(dòng)物模型中，與野生型apoA-I(wide type apoA-I，apoA-Iwt)和apoA-IM相比，A-I(N74C)突變體靜脈注射顯著抑制炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的表達(dá)和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺組織損傷。

4、r>　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 本研究利用pET原核表達(dá)和純化的重組載脂蛋白apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM，采用頸總動(dòng)脈套環(huán)的apoE-/-小鼠作為動(dòng)物模型，通過(guò)與apoA-Iwt和apoA-IM進(jìn)行比較，探討A-I(N74C)半胱氨酸突變體對(duì)小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化和血管重塑的保護(hù)作用及可能機(jī)制，并為我們深入理解apoA-I結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)

5、對(duì)重組載脂蛋白apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM進(jìn)行表達(dá)，快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)(AKTA FPLC System)對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，獲得高純度的重組蛋白(＞90％)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。純化后apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM蛋白經(jīng)Pierce親和柱去除重組蛋白內(nèi)殘量?jī)?nèi)毒素，鱟試劑法檢測(cè)內(nèi)毒素合格后與大豆卵磷脂包裝形成重組高密度脂蛋白(rHDL)：rHDLwt，rHDL74和rHDLmilano。利用

6、銅離子介導(dǎo)的低密度脂蛋白(LDL)氧化系統(tǒng)和硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)分析法檢測(cè)apoA-Iwt及其半胱氨酸突變體A-I(N74C)和apoA-IM的體外抗LDL氧化能力；將重組載脂蛋白與THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞共同孵育培養(yǎng)，分別利用油紅O染色和脂質(zhì)抽提法分析A-I(N74C)半胱氨酸突變對(duì)氧化LDL(oxLDL)的巨噬細(xì)胞吸收和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積的影響；28只雄性apoE-/-小鼠頸動(dòng)詠套環(huán)快速、定點(diǎn)誘導(dǎo)頸部動(dòng)脈粥樣硬化和血管重塑；

7、頸動(dòng)脈套環(huán)apoE-/-小鼠隨幾分為五組：生理鹽水對(duì)照組(0.3ml;n=5)、磷脂對(duì)照組(134mg/kg;n=5)、rHDLwt組（40mg/kg；n=6）、rHDL74組(40mg/kg；n=6)和rHDLmilano組(40mg/kg；n=6)。各組動(dòng)物頸動(dòng)脈套環(huán)后5天給予生理鹽水、磷脂和rHDLs尾靜脈注射，每隔10天注射一次，共三次。最后一次注射后24小時(shí)，摘眼球取血，分離血清，采用酶法測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(T

8、G)和HDL膽固醇(HDL-C)含量；血清鐵還原能力分析法(FRAS)檢測(cè)apoE-/-小鼠血清總抗氧化能力；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清炎癥因子IL-6的含量；apoE-/-小鼠固定，PBS灌流，取雙側(cè)頸總動(dòng)脈置于10％中性緩沖福爾馬林中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡觀察rHDL74靜脈注射對(duì)頸As面積、內(nèi)中膜比值和斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量的影響；利用大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體，免疫組化檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量。

9、
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 體外抗LDL氧化實(shí)驗(yàn)：與apoA-lwt相比，重組蛋白A-I(N74C)和apoA-IM顯著抑制銅離子介導(dǎo)的LDL氧化，并且A-I(N74C)和apoA-IM的抗氧化活性相似。為了排除A-I(N74C)的抗氧化作用與半胱氨酸突變引入游離巰基的關(guān)系，我們?cè)诜磻?yīng)體系中加入與apoA-Iwt摩爾濃度相同的還原型谷胱甘肽(GSH)。重組蛋白apoA-Iwt、A-I(N74C)和apoA-IM的半數(shù)抑制濃

10、度(IC50)分別達(dá)到264、72和67μg/ml，而apoA-lwt+GSH組的半數(shù)抑制濃度降為238μg/ml。
　　 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積實(shí)驗(yàn)：油紅O染色結(jié)果顯示apoA-lwt組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積面積比對(duì)照組減少30.65％，而A-I(N74C)和apoA-IM組分別減少56.78％和61.08％。有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，A-I(N74C)和apoA-IM組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量比apoA-Iwt組顯著降低，與油紅O染色結(jié)果相一致。提

11、示重組蛋白A-I(N74C)能夠抑制oxLDL的細(xì)胞吸收和降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積，其抑制作用與apoA-IM相似。
　　 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：rHDL74靜脈注射顯著降低血清TC和非HDL-C水平，其降血脂作用與rHDLwt組相似，低于rHDLmilano組；與rHDLwt和rHDLmilano組相比，rHDL74給藥組apoE-/-小鼠血清總抗氧化能力顯著升高；rHDLwt靜脈注射24小時(shí)后，血清IL-6水平升高至315.0±32.5p

12、g/ml。與rHDLwt組相比，rHDLmilano和rHDL74靜脈注射分別使小鼠血清IL-6水平降低17％和32％，達(dá)到261.5±35.2pg/ml和215.6±19.4pg/ml。提示rHDL74具有比rHDLwt和rHDLmilano更強(qiáng)的抗炎和抗氧化功能；與rHDLwt組相比，rHDL74靜脈注射顯著降低頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積和血管內(nèi)中膜比值、減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞含量，其體內(nèi)抗As和血管重塑作用與rHDLmilano相似

13、。
　　 結(jié)論：
　　 1.A-I(N74C)半胱氨酸突變能夠增強(qiáng)重組蛋白的體外抗LDL氧化能力，其抗氧化功能與apoA-IM相似。A-I(N74C)突變體抗氧化活性的增強(qiáng)并不僅是半胱氨酸突變引入游離巰基的結(jié)果，可能與突變體本身結(jié)構(gòu)和功能的改變以及突變體蛋白與反應(yīng)底物之間的相互作用有關(guān)。
　　 2.A-I(N74C)半胱氨酸突變能夠抑制oxLDL的巨噬細(xì)胞吸收和降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積，其抑制作用與apoA-IM相似。

14、結(jié)合以前膽固醇流出實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)血脂分析結(jié)果，提示A-I(N74C)降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積作用不是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出過(guò)程，而是通過(guò)抑制LDL的氧化和oxLDL的細(xì)胞吸收。
　　 3.與rHDLwt和rHDLmilano組相比，rHDL74靜脈注射顯著降低血清IL-6水平和增強(qiáng)血清總抗氧化能力，提示A-I(N74C)半胱氨酸突變能夠顯著增強(qiáng)重組蛋白的體內(nèi)抗炎和抗氧化能力。
　　 4.與rHDLwt組相比，rHDL74靜脈注射

15、顯著降低apoE-/-小鼠頸As斑塊面積和血管內(nèi)中膜比值、減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞含量，其抗As和血管重塑作用與rHDLmilano相似。
　　 5.A-I(N74C)半胱氨酸突變體的抗As和血管重塑功能可能是來(lái)源于突變體蛋白增強(qiáng)的抗炎和抗氧化活性，而不是對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的促進(jìn)功能。
　　 第二部分：重組高密度脂蛋白作為藥物載體的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究
　　 癌癥（惡性腫瘤）是對(duì)人類健康危害最嚴(yán)重的疾病之一。目前大多數(shù)

16、化療藥物仍存在不同程度對(duì)靶細(xì)胞的選擇性或藥物耐受性差、毒副作用強(qiáng)、水溶性不足等缺陷，使抗腫瘤藥物在靶細(xì)胞中難以達(dá)到發(fā)揮治療作用的有效濃度。HDL是人體內(nèi)體積最小、密度最高的脂蛋白，具有獨(dú)特的親水性.疏水性結(jié)構(gòu)、內(nèi)源性可完全降解以及不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別和清除等多種作為藥物載體的特性。以HDL作為藥物載體，可以通過(guò)受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)藥物的細(xì)胞吸收。在HDL與受體的結(jié)合過(guò)程中，HDL的主要蛋白質(zhì)成分apoA-I發(fā)揮關(guān)鍵作用。成熟型apoA-I

17、最顯著的特征是含有8個(gè)22個(gè)氨基酸和2個(gè)11個(gè)氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列之間被脯氨酸隔開(kāi)。ApoA-IM和apoA-IParis是apoA-I的天然半胱氨酸突變體，其突變體攜帶者表現(xiàn)為增強(qiáng)的心血管保護(hù)活性。ApoA-IM和apoA-IPali。突變位點(diǎn)分別位于螺旋6和螺旋5的雙性α螺旋親、疏水性交界面上，突變位點(diǎn)在多肽鏈位置上恰好相隔22個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)突變發(fā)生的特殊位置，我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并構(gòu)建了七種半胱氨酸突變體：A-I(S5

18、2C),A-I(N74C),A-I(K107C),A-I(G129C),A-I(R173C),A-I(K195C)及A-I(S228C)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 本研究利用pET原核表達(dá)和純化的重組載脂蛋白apoA-Iwt及7種apoA-I半胱氨酸突變體，流式細(xì)胞術(shù)挑選出受體結(jié)合力最高的半胱氨酸突變體apoA-IM用于構(gòu)建藥物載體。通過(guò)與10-羥基喜樹(shù)堿(HCPT)、普通藥物脂質(zhì)體和rHDL

19、wt-HCPT藥物脂質(zhì)體進(jìn)行比較，重點(diǎn)觀察rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體對(duì)包封藥物體外釋藥、體內(nèi)組織分布和體外抗腫瘤活性的影響，探討rHDLM作為藥物載體對(duì)抗腫瘤藥物HCPT水溶性、緩釋作用、組織分布和細(xì)胞毒性等的改善作用，進(jìn)一步探索利用apoA-I突變體或模擬肽作為藥物載體的可行性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 pET原核表達(dá)和純化重組蛋白apoA-Iwt及7種半胱氨酸突變體。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記重組載脂蛋白，流

20、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同部位半胱氨酸突變對(duì)apoA-I受體結(jié)合力的影響，選擇受體結(jié)合力增強(qiáng)的apoA-IM突變體制備藥物載體。分別利用apoA-Iwt和apoA-IM重組蛋白，按照不同藥脂比薄膜分散法制備rHDL-HCPT藥物脂質(zhì)體：rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT，并分析不同藥脂比對(duì)藥物脂質(zhì)體包封率的影響。按照包封率最高的藥脂比制備藥物脂質(zhì)體，分別利用磷脂測(cè)定試劑盒、BCA法和分光光度法檢測(cè)藥物脂質(zhì)體內(nèi)的磷脂、蛋白和HCPT藥物的

21、含量，分析藥物脂質(zhì)體內(nèi)的成分組成和有效載藥率。透射電鏡觀察rHDL-HCPT藥物脂質(zhì)體的形態(tài)，軟件計(jì)算藥物脂質(zhì)體的平均直徑。采用1％、3％、5％蔗糖和5％、10％、15％每藻糖作為冷凍干燥保護(hù)劑，觀察不同凍干保護(hù)劑對(duì)藥物脂質(zhì)體藥物滲漏和脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)作用。體外釋藥實(shí)驗(yàn)觀察游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體、rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體的體外釋藥曲線。尾靜脈注射10mg/kg游離HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)

22、體，靜脈注射后0.5、1、3、5、24小時(shí)，摘眼球取血，分離血漿。取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織，稱重后組織勻漿，熒光法檢測(cè)血漿和各組織勻漿內(nèi)HCPT藥物含量。利用SKOV-3和HCT-116癌細(xì)胞，通過(guò)與游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT藥物脂質(zhì)體進(jìn)行比較，觀察rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體對(duì)HCPT細(xì)胞毒性的增強(qiáng)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 受體結(jié)合力分析：與apoA-Iwt相比，apoA

23、-IM突變體的相對(duì)受體親和力顯著升高，而A-I(S52C)、A-I(K107C)和A-I(G129C)突變體蛋白的相對(duì)受體親和力顯著降低。載脂蛋白A-I(N74C)、A-I(K195C)和A-I(S228C)半胱氨酸突變蛋白的受體親和力未見(jiàn)明顯影響。
　　 藥物脂質(zhì)體的制備：藥脂比為1:20時(shí)可以獲得最大藥物包封率。rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體內(nèi)磷脂成分占65.15％，apoA-I成分占30.54％，載藥量達(dá)到4.31％。制備

24、完成的rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體顆粒絕大多數(shù)呈圓球形，直徑分別為25.36±10.47mn和22.39±10.25nm，與體內(nèi)天然存在的HDL相似。利用3％蔗糖作為凍干保護(hù)劑可以有效保護(hù)藥物脂質(zhì)體的藥物滲漏和脂質(zhì)過(guò)氧化。體外釋藥實(shí)驗(yàn)：rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體體外釋藥表現(xiàn)為穩(wěn)定緩釋曲線。游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT藥物脂質(zhì)體24小時(shí)累積釋藥量分別達(dá)到90.7

25、％、65.％和41.3％，而rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體僅有26.9％的藥物釋出。
　　 體內(nèi)組織分布：游離HCPT靜脈注射后藥物主要分布在肝、腎和血漿中，但最高藥物濃度均不超過(guò)7μg/g組織。與游離HCPT相比，rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體靜脈注射半小時(shí)使肝、腎和脾臟的藥物濃度分別增加5.5、15.4和32.3倍，肺臟和血漿藥物濃度增加1.8倍和1.3倍。游離HCPT靜脈注射5小時(shí)后，血漿內(nèi)幾乎檢測(cè)不到HCPT存在，而rH

26、DLM-HCPT藥物脂質(zhì)體靜脈注射24小時(shí)后，血漿藥物濃度仍維持在0.421μgGHHCPT/ml。同時(shí)，rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體靜脈注射24小時(shí)后，其肝、腎、脾和肺臟藥物濃度比游離HCPT靜脈注射分別升高2.2-5.7倍。
　　 體外抗腫瘤活性：與游離HCPT相比，普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT分別使藥物對(duì)SKOV-3細(xì)胞的IC50降低27倍和58倍，而rHDLM-HCPT則降低70倍。與游離HCPT和普通藥物脂

27、質(zhì)體相比，rHDLM-HCPT作為藥物載體使HCPT藥物對(duì)HCT-116細(xì)胞的IC50分別降低50倍和10倍。即使與rHDLwt-HCPT相比，rHDLM-HCPT對(duì)HCT-116細(xì)胞的IC50仍然降低30％左右。
　　 結(jié)論：
　　 1.ApoA-I不同部位半胱氨酸突變對(duì)受體親和力的影響不同。ApoA-IM突變體比apoA-lwt顯著升高的受體親和力使其更適宜于藥物載體的制備。
　　 2.選擇apoA-IM突變

28、體制備藥物載體，薄膜分散法制備rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體。當(dāng)藥脂比為1:20時(shí)，rHDLM-HCPT藥物脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最高，載藥率為4.31％。薄膜分散法制備完成的藥物脂質(zhì)體絕大部分呈圓球形，直徑與天然HDL相似。
　　 3.冷凍干燥可以減少藥物脂質(zhì)體內(nèi)藥物滲漏和脂質(zhì)過(guò)氧化。利用3％蔗糖作為凍干保護(hù)劑可以有效發(fā)揮對(duì)藥物脂質(zhì)體的保護(hù)作用。
　　 4.rHDLM作為藥物載體使HCPT藥物體外釋藥呈現(xiàn)穩(wěn)定緩釋曲線，其緩

29、釋作用顯著強(qiáng)于游離HCPT、普通藥物脂質(zhì)體和rHDLwt-HCPT藥物脂質(zhì)體。
　　 5.與游離HCPT相比，rHDLM作為藥物載體可以顯著增強(qiáng)HCPT在血漿、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要器官的藥物濃度，并且延長(zhǎng)藥物濃度的維持時(shí)間。
　　 6.rHDLM作為藥物載體可以顯著增強(qiáng)HCPT對(duì)SKOV-3卵巢癌細(xì)胞和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。綜上說(shuō)述，利用rHDLM作為藥物載體可以顯著改善抗腫瘤藥物HCPT水溶性不足

30、、半衰期短、組織分布特異性和選擇性差的缺陷，并且增強(qiáng)藥物的體外抗腫瘤活性。rHDLM作為藥物載體對(duì)藥物物理化學(xué)性質(zhì)和體外抗腫瘤活性的改善作用表明利用apoA-I突變體或模擬肽作為藥物載體的嘗試具有可行性。然而，rHDLM作為藥物載體對(duì)抗腫瘤藥物的組織選擇性、藥物濃度維持和抗腫瘤活性的影響還需要進(jìn)一步在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 第三部分：不同比例載脂蛋白A-I與載脂蛋白A-V重組脂質(zhì)體對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　 載脂蛋白A-V

31、（apolipoprotein A-V，apoA-V）是2001年通過(guò)對(duì)人類和小鼠DNA基因組比對(duì)分析中偶然發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白家族新成員。ApoA-V轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠研究表明apoA-V具有調(diào)節(jié)血漿TG代謝的功能，與人體內(nèi)TG的代謝和清除密切相關(guān)。ApoA-I是HDL的主要蛋白質(zhì)成分，在膽固醇代謝和抗As中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ApoA-I與apoA-V基因都位于人11號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)3帶的apoA-I/CIII/AIV/AV基因簇中，此基

32、因簇中表達(dá)的多個(gè)基因均在膽固醇和甘油三酯代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。盡管apoA-V在體內(nèi)含量很低，大多數(shù)apoA-V在體內(nèi)存在于HDL中，并且可以迅速?gòu)腍DL向VLDL進(jìn)行轉(zhuǎn)移。同時(shí)，apoA-V在體內(nèi)過(guò)表達(dá)能夠影響HDL的含量和成熟過(guò)程。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)apoA-V蛋白與HDL之間可能存在某種相關(guān)性，apoA-V對(duì)HDL結(jié)構(gòu)和功能的影響仍知之甚少。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 原核表達(dá)和純化的apoA-V和apoA-I蛋白，

33、利用不同比例的apoA-V和apoA-I重組蛋白，膽酸鈉透析法制備rHDL。通過(guò)對(duì)rHDL的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及脂質(zhì)結(jié)合能力、體外抗氧化、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積、LPL激活和VLDL清除等apoA-I和apoA-V相關(guān)功能的檢測(cè)，觀察rHDL內(nèi)不同比例apoA-V對(duì)rHDL結(jié)構(gòu)和功能的影響。我們希望對(duì)這些問(wèn)題的研究和揭示能夠?qū)ξ覀兏钊?、更全面的了解apoA-V的功能及作用機(jī)制有所幫助。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)

34、重組蛋白apoA-lwt進(jìn)行表達(dá)，快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。原核表達(dá)和純化apoA-V重組蛋白，725mM膽酸鈉或50mM檸檬酸鈉溶液(pH3.0)溶解用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用不同比例的apoA-V和apoA-I重組蛋白，膽酸鈉透析法制備rHDL。分別利用磷脂測(cè)定試劑盒和BCA法檢測(cè)重組脂質(zhì)體中磷脂和蛋白含量，分析制備前后重組脂質(zhì)體中磷脂/蛋白比值的改變情況。DMPC濁度澄清實(shí)驗(yàn)分析不同比例apoA-V和apoA-I蛋白混合物

35、的脂質(zhì)結(jié)合能力。透射電鏡觀察負(fù)染rHDL的形態(tài)，Image Proplus 6.0軟件計(jì)算rHDL的平均直徑。利用體外銅離子介導(dǎo)的LDL氧化系統(tǒng)和TBARS分析法檢測(cè)rHDL的體外抗LDL氧化能力；利用THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞分析rHDL對(duì)oxLDL的巨噬細(xì)胞吸收和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積的影響；體外LPL激活實(shí)驗(yàn)用于分析rHDL內(nèi)apoA-V對(duì)LPL活性的激舌作用；利用HepG2細(xì)胞觀察rHDL內(nèi)apoA-V對(duì)熒光標(biāo)記VLDL的細(xì)胞吸收和清余的

36、影響：利用雄性BALB/c小鼠，體內(nèi)觀察rHDL內(nèi)apoA-V對(duì)血漿內(nèi)Dil-VLDL青除的影響；將含apoA-V的rHDL與VLDL在37℃條件下共同孵育30min,密度弟度離心分離VLDL，觀察rHDL內(nèi)apoA-V從rHDL向VLDL的轉(zhuǎn)移。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 rHDL的制備：原核表達(dá)和純化apoA-I和apoA-V蛋白，采用不同比例的apoA-I陽(yáng)apoA-V重組蛋白，膽酸鈉透析法制備形成六種rHDL:AI

37、-rHDL，AV-rHDL，(1:1)-rHDL，(10:1)-rHDL，(100:1)-rHDL和(1000:1)-rHDL。SDS-PAGE電泳鑒定重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-I和apoA-V的質(zhì)量比與加入初始比例相一致。隨著apoA-V含量的噌加，rHDL內(nèi)磷脂/蛋白比值逐漸升高。DMPC濁度澄清實(shí)驗(yàn)證實(shí)apoA-V的脂質(zhì)結(jié)合能力略高于apoA-I。透射電鏡結(jié)果表明隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加，rHDL的平均直徑逐漸增大，這可能

38、是由于apoA-V比apoA-I增強(qiáng)的脂質(zhì)結(jié)合能力使apoA-V含量更高的rHDL可以結(jié)合更多的脂質(zhì)，從而導(dǎo)致rHDL體積的增加。
　　 體外抗LDL氧化實(shí)驗(yàn)：隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加，rHDL的體外抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證apoA-V的抗氧化活性，我們?cè)谙嗤緼I-rHDL的基礎(chǔ)上，加入不同量的AV-rHDL，結(jié)果隨著AV-rHDL含量的增加，重組脂質(zhì)體混合物的抗氧化活性逐步增加，表明rHDL內(nèi)apoA-

39、V成分可以增強(qiáng)rHDL的抗氧化活性。脂質(zhì)游離型apoA-V在體外同樣表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，其抗氧化活性低于脂質(zhì)結(jié)合型。
　　 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積實(shí)驗(yàn)：AI-rHDL能夠顯著抑制oxLDL的細(xì)胞吸收和細(xì)胞內(nèi)月旨質(zhì)累積。然而，隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的升高，THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積顯著增加。
　　 LPL激活實(shí)驗(yàn)：rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加不僅沒(méi)有增強(qiáng)LPL的水解活性，反而抑制LPL引發(fā)的TG水解作用。將

40、含apoA-V的rHDL與VLDL共同孵育30min后，再加入其它反應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果仍沒(méi)有增加apoA-V的LPL激活活性。體內(nèi)外VLDL清除實(shí)驗(yàn)：隨著rHDL內(nèi)apoA-V含量的增加，VLDL的細(xì)胞吸收和體內(nèi)清除逐漸減少。在給予rHDL之前靜脈注射硫酸魚(yú)精蛋白以抑制血漿LPL的活性，結(jié)果在LPL活性被抑制的情況下，血漿內(nèi)VLDL的清除被完全抑制，表明LPL對(duì)于VLDL的體內(nèi)清除是至關(guān)重要的。
　　 ApoA-V轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：將

41、含有apoA-V的rHDL與VLDL共同孵育后，VLDL內(nèi)的apoA-V濃度未見(jiàn)明顯升高，表明apoA-V沒(méi)有發(fā)生從rHDL向VLDL的轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用不同比例重組apoA-V和apoA-I蛋白，膽酸鈉透析法制備rHDL。由于apoA-V比apoA-I增強(qiáng)的脂質(zhì)結(jié)合能力，制備完成的rHDL隨著apoA-V含量的增加，其磷脂/蛋白比值和直徑逐漸增大。
　　 2.體外抗LDL氧化實(shí)驗(yàn)表明，apoA

42、-V重組蛋白具有抗LDL氧化活性。rHDL內(nèi)apoA-V增強(qiáng)的抗氧化活性可能與apoA-V本身抗氧化功能或apoA-V與apoA-I和磷脂之間的相互作用有關(guān)。
　　 3.ApoA-V和apoA-I重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-V成分對(duì)oxLDL的巨噬細(xì)胞吸收和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積沒(méi)有作用，其活性取決于rHDL內(nèi)的apoA-I成分。
　　 4.ApoA-V和apoA-I重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-V體外對(duì)LPL活性沒(méi)有激活作用。隨著rHDL內(nèi)

43、apoA-V含量的升高，rHDL反而抑制反應(yīng)體系內(nèi)LPL的TG水解活性。
　　 5.在體內(nèi)外VLDL清除實(shí)驗(yàn)中，apoA-V和apoA-I重組脂質(zhì)體內(nèi)apoA-V均未促進(jìn)VLDL的清除。血漿LPL對(duì)于體內(nèi)VLDL的清除至關(guān)重要。
　　 6.在37℃孵育條件下，rHDL內(nèi)的apoA-V不能從rHDL轉(zhuǎn)移至VLDL中。
　　 7.rHDL內(nèi)apoA-V對(duì)體外LPL激活和體內(nèi)外VLDL清除的失活，可能是由于rHDL內(nèi)的