兩種侵染蘿卜的雙鏈RNA病毒研究.pdf

1、從杭州市郊采集若干株葉片有黃邊的一品紅蘿卜植株，利用抽提dsRNA的方法從葉片中獲得4條大小在1400-2000bp范圍的dsRNA條帶。從葉片中提取病毒粒子，在電鏡下觀察到一種直徑在28-30nm之間的球狀病毒粒子。對(duì)病毒粒子進(jìn)行核酸提取，結(jié)果顯示病毒基因組為dsRNA形式，且條帶的數(shù)目和大小與直接從葉片上提取的條帶一致，顯示該四條dsRNA均來源于病毒本身。此外，在某些蘿卜樣品中只發(fā)現(xiàn)含有兩條較大的dsRNA。 利用經(jīng)修改的

2、SPAT和RT-PCR方法獲得全部dsRNA條帶的cDNA?？寺『蜏y(cè)序的結(jié)果顯示兩條較大的dsRNA條帶分別為1866bp和1791bp，被命名為RasR1和RasR2(RaphanusSativusRNA)。軟件分析顯示RasR1和RasR2在正鏈中都含有一個(gè)ORF，編碼的蛋白分子量分別為66.9和55.9kDa。在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST-P程序搜尋序列與之相似的蛋白并以此推測(cè)RasR1和RasR2的功能。結(jié)果顯示有26

3、條蛋白的序列與RasR1編碼的蛋白有同源性且這26條蛋白均為Partitiviridae成員所編碼的RdRp序列；對(duì)RasR1及相似蛋白序列進(jìn)行聯(lián)配分析，結(jié)果顯示RasR1編碼的蛋白也含有所有Partitiviridae成員RdRp序列所特有的6個(gè)保守區(qū)。對(duì)RasR2進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)四條序列相近的蛋白，且均為同科病毒編碼的CP序列。以上分析表明RasR1與RasR2的功能分別是編碼侵染蘿卜病毒的RdRp和CP。另外，RasR1與RasR2的

4、5′端UTR高度保守，并含有相同的5′末端序列(5′-AGAAAAAUUU-3′)；另一方面，兩條序列的3′末端都含有一段富含A/U的區(qū)域，并都以5′-AAAAUAAAACC-3′結(jié)尾。 根據(jù)5％聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，兩條較小的dsRNA條帶含量遠(yuǎn)低于RasR1與RasR2?？寺y(cè)序結(jié)果顯示最小的電泳條帶RNA4實(shí)際包含兩條獨(dú)立的dsRNA。它們與RNA3根據(jù)分子量的由大到小的順序被命名為RasR3、RasR4和RasR5。

5、RasR3的長(zhǎng)度為1717bp，正鏈含有一個(gè)ORF，能夠編碼一個(gè)約為55.3kDa蛋白。BLAST-P搜索結(jié)果顯示該蛋白也與10條Partitiviridae成員的RdRp序列具有同源性，并含有全部6個(gè)保守區(qū)。RasR4與RasR5的長(zhǎng)度分別1521bp和1486bp。兩條序列的正鏈都含有一個(gè)ORF，編碼的蛋白分子量分別為38.2kDa與38.8kDa，但在GenBank數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)與RasR4和RasR5或與它們編碼的蛋白相似的核苷

6、酸或氨基酸序列，因此這兩條序列的功能目前未知。RasR3、RasR4和RasR5的5′UTR高度保守，且含有相同的5′末端(5′-GAUAAUG-3′)，但與RasR1和RasR2的5′UTR顯著不同。 此外，RasR3、RasR4和RasR5在3′UTR都不含A/U富集區(qū)，并且在序列上與RasR1和RasR2也顯著不同。 綜合上述結(jié)果顯示，所克隆的五條dsRNA可能分屬兩種獨(dú)立的病毒。根據(jù)RasR1與RasR2可以獨(dú)立

7、存在于寄主中的事實(shí)和序列比對(duì)的結(jié)果以及ICTV對(duì)Partitiviridae成員的描述，這兩條序列可能來源于同一個(gè)Partitiviridae的未知病毒，暫定名為Raphanussativusvirus1(RasV1)。而RasR3可能來源于同科的另一個(gè)成員，暫定名為Raphanussativusvirus2(RasV2)。RasR4與RasR5由于功能未知，考慮到完整的RasV2基因組還需要編碼CP的序列，以及這兩條dsRNA的UTR