結(jié)腸癌脂肪酸代謝特點(diǎn)及DNA甲基化關(guān)系的研究.pdf

1、[目的]
　　 建立氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析組織脂肪酸和DNA甲基化方法，比較結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織脂肪酸的相對含量變化以及DNA甲基化水平的改變，尋找脂肪酸代謝和DNA甲基化在腫瘤組織中的特點(diǎn)，探討脂肪酸代謝以及DNA甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系，為研究脂類與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系和腫瘤診斷標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 (1)組織脂肪酸提取以及分析：采用脂肪酸提取衍生一步法，在組織

2、中加入正己烷和14％三氟化硼/甲醇，充氮?dú)夂竺芊猓?00℃水浴加熱1小時(shí)后加入三重蒸餾水，然后吸取上清，用氮?dú)獯蹈珊?，再用正己?50μL定容，最后用氣相色譜質(zhì)譜儀分析組織脂肪酸含量。
　　 (2)組織DNA提?。涸诮M織中加入蛋白酶K進(jìn)行消化，然后加入苯酚-氯仿進(jìn)行除蛋白，最后加入乙醇把DNA沉淀下來，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度以及純度的檢測。
　　 (3)組織DNA裂解：DNA樣品加入88％甲酸在140℃反應(yīng)90

3、min進(jìn)行裂解。
　　 (4)氣相色譜質(zhì)譜分析DNA甲基化：裂解后的DNA氮?dú)獯蹈珊螅尤隑STFA(1％TMCS)，乙腈和吡啶進(jìn)行衍生，然后離心，取上清，然后用氣相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。
　　 (5)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析組織DNA甲基化：裂解后的DNA氮?dú)獯蹈珊?，用甲醇溶解后離心，取上清，然后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)通過分析35例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織的脂肪酸，

4、比較腫瘤組織和癌旁組織之間脂肪酸的差異，SFA、18:0/18:1、20:2和n-6/n-3在腫瘤組織中的含量比癌旁組織的高且具有顯著性差異，18:1、20:5、20:5/20:4、22:6/22:4在腫瘤組織中的含量比癌旁組織低也具有顯著性差異。
　　 (2)通過比較不同腫瘤分期的結(jié)直腸癌患者中脂肪酸含量，比較不同腫瘤分期的脂肪酸之間的差異，發(fā)現(xiàn)C期結(jié)腸癌患者腫瘤組織中18:2和n-6脂肪酸的含量比B期高具有顯著性差異。

5、>　　 (3)在建立氣相色譜質(zhì)譜檢測組織DNA甲基化方法時(shí)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的衍生條件，得到其最佳衍生條件為100℃下加入50μLBSTFA(1％TMCS)，40μL乙腈和10μL吡啶反應(yīng)45min。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶衍生物在氣相色譜質(zhì)譜分析方法中容易分離，且最低檢測限為0.05ng，日內(nèi)RSD分別為2.11％和5.23％，日間RSD分別為4.80％和9.41％，相對回收率分別為88.52％和92.35％。<

6、br>　　 (4)在建立液相色譜質(zhì)譜檢測組織DNA甲基化方法時(shí)，通過乙腈和甲酸銨在親水柱中達(dá)到分離，且胞嘧啶的線性范圍為(1～100)ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9974，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70％～4.09％；5-甲基胞嘧啶的線性范圍為(1～50)ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9948，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60％～4.81％。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的檢出限為1pg，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.94％～2.83％，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.17％～4

7、.44％，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加樣回收率為86.52％～105.14％。
　　 (5)通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織中DNA程度，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的DNA甲基化水平比癌旁組織的DNA甲基化低(P<0.05)，表示低甲基化有利于腫瘤的發(fā)生。另外比較不同腫瘤分期結(jié)腸癌患者組織DNA甲基化的差異，發(fā)現(xiàn)處于C期的結(jié)直腸癌患者中的DNA甲基化水平比處于B期的低(P<0.05)。
　　 (6)通過分析組織中

8、脂肪酸含量以及DNA甲基化程度，發(fā)現(xiàn)組織脂肪酸與DNA甲基化具有一定的相關(guān)性，如16:0、18:1、18:2、20:4、22:4、n-6、n-6/n-3和18:0/18:1在組織中含量或比值增加，其相對應(yīng)的DNA甲基化水平則降低(P<0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 本文建立了氣相色譜質(zhì)譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析組織脂肪酸和DNA甲基化的方法，運(yùn)用該方法分析了結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織中脂肪酸以及DNA甲基化的程度。