結(jié)腸癌T-cadherin基因的表達(dá)及甲基化影響的探討.pdf

1、目的：結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，而DNA甲基化與結(jié)腸癌的關(guān)系密切，在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著極其重要的角色。DNA異常甲基化是可使腫瘤抑制基因發(fā)生沉默的新型相關(guān)研究機(jī)制。本研究的主要目的是了解T-鈣粘蛋白(T-cadherin)在結(jié)腸癌中的基因功能，檢測T-cadherin基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)，通過去甲基化藥物5-雜氮-2’-脫氧胞苷酸(5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)對結(jié)腸癌

2、細(xì)胞株在體外和體內(nèi)作用的研究，檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、T-cadherin甲基化狀態(tài)改變和T-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)變化，探討DNA甲基化異常與結(jié)腸癌間的相關(guān)性及5-Aza-CdR抑制結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型和逆轉(zhuǎn)甲基化狀態(tài)的作用及其機(jī)制。
　　 方法：1、用5-Aza-CdR處理結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，然后采用倒置相差顯微鏡觀察藥物處理前后細(xì)胞的變化；采用MTT法觀察細(xì)胞的生長速度變化；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周

3、期及細(xì)胞凋亡率；用甲基化特異性PCR(MSP)檢測T-cadherin基因5'CpG島甲基化狀態(tài)；采用RT-PCR和Western Blotting法檢測T-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)情況。2、建立人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，比較5-Aza-CdR給藥組和對照組裸鼠移植瘤生長變化，并用MSP、RT-PCR、Western Blotting及免疫組織化學(xué)技術(shù)對裸鼠移植瘤組織進(jìn)行T-cadherin基因5'CpG島

4、甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白表達(dá)變化的檢測。
　　 結(jié)果：1、倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈多邊形，貼壁生長，核大、核分裂相多見，細(xì)胞數(shù)量和增殖速度明顯快于給藥組；給藥組細(xì)胞大小較均勻，形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞變圓，皺縮，胞核固縮、增殖分裂減慢，部分細(xì)胞有凋亡和壞死；MTT檢測發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR對HCT116細(xì)胞的生長有抑制作用，隨濃度的增加而增加；用5μmol/L該藥處理細(xì)胞五天后，細(xì)胞G0/G1期延長，由19.6％

5、增加到60.8％；而S期和G2期均縮短，S期由50.8％減少到24.2％，G2期由18.2％減少到16.3％；細(xì)胞總凋亡率給藥組與對照組比較，其總凋亡率增加了30.27％；MSP檢測經(jīng)5μmol/L5-Aza-CdR處理五天的HCT116細(xì)胞后，對照組T-cadherin基因啟動子區(qū)域用特異性甲基化引物擴(kuò)增出目的基因帶，去甲基化引物未見擴(kuò)增出目的基因帶，而給藥組T-cadherin基因用去甲基化引物均擴(kuò)增出目的基因帶，但甲基化引物均未見

6、擴(kuò)增出目的基因帶，未加DNA模板對照組均未能檢測T-cadherin基因甲基化引物擴(kuò)增片段及去甲基化物擴(kuò)增片段；RT-PCR檢測對照組T-cadherin基因mRNA不能擴(kuò)增出特異性條帶，而給藥組HCT116細(xì)胞中可檢測到T-cadherin基因mRNA表達(dá)；WesternBlotting檢測對照組HCT116細(xì)胞中T-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯低于給藥組。2、成功建立人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，成瘤率為100％，成

7、瘤時間為腫瘤細(xì)胞接種后第8-11天，腫瘤細(xì)胞接種后第11天，裸鼠移植瘤直徑平均約4mm；5-Aza-CdR處理荷瘤裸鼠14天后，給藥組裸鼠形成的腫瘤體積較對照組腫瘤體積小，腫瘤體積的差異隨給藥時間的延長而增大，給藥28天后腫瘤體積差異最明顯，4周末處死裸鼠后，給藥組的腫瘤體積為907±87.29 mm3，對照組為1370.93±130.20 mm3，給藥組腫瘤體積明顯小于對照組的腫瘤體積(t=4.4209，P<0.005)，抑瘤率為34

8、％；用藥后各組荷瘤裸鼠用藥后體重均有增加，4周末處死裸鼠后，給藥組荷瘤裸鼠平均體重為18.06±1.29 g，對照組為17.07±0.84 g，給藥組荷瘤裸鼠體重與對照組無明顯變化，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.3745，P>0.10)；MSP檢測結(jié)果顯示結(jié)腸癌裸鼠移植瘤組織中T-cadherin基因在對照組僅有甲基化條帶被擴(kuò)增，而給藥組腫瘤組織中出現(xiàn)非甲基化條帶；RT-PCR結(jié)果顯示對照組結(jié)腸癌裸鼠種植瘤組織中T-cadherin mRN

9、A均未見表達(dá)，而給藥組各種植瘤中可見T-cadherin mRNA表達(dá)；Western Blotting結(jié)果顯示給藥組腫瘤組織中T-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組；免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)對照組裸鼠種植瘤細(xì)胞膜上均未見T-cadherin陽性著色，而給藥組裸鼠種植瘤細(xì)胞膜上可見明顯的棕黃色陽性著色。
　　 結(jié)論：1、T-cadherin基因在結(jié)腸癌中表達(dá)缺失或下調(diào)，其與該基因啟動子甲基化有關(guān)，可能是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的原因之一；