應用MALDI-TOF-MS技術篩選異丙酚對內毒素血癥大鼠有影響的血清蛋白.pdf

1、膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應征候群,膿毒癥的嚴重并發(fā)癥.感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術后病人最主要的死亡因為之一,盡管抗生素被廣泛應用,并且有重癥監(jiān)護的支持,死亡率仍高達35～60％。統(tǒng)計表明,臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negtive bacteria)引起的,在革蘭氏陰性菌的細胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或稱為內毒素(endotoxin),被認為是革蘭

2、氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。細菌破裂時,LPS被釋放出來,廣泛作用于機體多組織器官,其中內皮細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞是最主要的效應細胞,在LPS的刺激下,它們產生大量的細胞因子,即“細胞因子風暴”(cytokin storm),進而引起失控性的炎癥級聯(lián)反應,包括出血、白細胞侵潤、血管擴張和血漿蛋白滲出、水腫等,導致微循環(huán)障礙、有效循環(huán)血量減少,最終引起內毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙。
　　 異丙酚(propof

3、ol)又名得普利麻,化學名稱2,6二丙基苯酚,是一種惰性的酚類衍生物,在靜脈麻醉中以起效快、時效短、蘇醒早,而在臨床廣泛推廣應用。異丙酚現(xiàn)已廣泛用于膿毒癥、嚴重創(chuàng)傷等重危病人及ICU有監(jiān)測條件下的麻醉和鎮(zhèn)靜。近年有大量研究表明異丙酚可有效控制創(chuàng)傷、外科手術等過程中LPS引起的炎癥反應,其在臨床應用中的控制LPS引起的炎癥反應作用越來越引起關注。研究表明異丙酚可能通過a、抑制中性粒細胞的趨化,黏附聚集；b、抑制炎性因子的釋放及呼吸爆發(fā)；c

4、、調節(jié)中性粒細胞凋亡等三個方面抑制白細胞過度激活所導致的炎癥損傷反應。
　　 目的:在膿毒癥的發(fā)生過程中,可以產生大量的炎癥介質,包括細胞因子,趨化因子,補體等,這些炎癥介質可以激活內皮細胞促進粘附因子的表達,引起血小板的粘附和白細胞的滲出,目前基本上所有對異丙酚抑制炎癥反應方面的研究,都僅僅停留在一些臨床指標的觀測上,沒有能夠深入到分子水平上來探討。即使是近來部分研究有分子水平上的探討,但也僅僅是局限在采用幾個細胞因子指標,通

5、過不同的干預方式來檢測一下其表達水平的變化,從而進行初步地探討,也沒有能夠系統(tǒng)地深入到分子機制水平上來,對臨床的指導意義也十分有限。機體的任何反應都是通過其復雜的細胞信號轉導系統(tǒng)一步步實現(xiàn)的。因此我們采用蛋白質組學的實驗方法,以血清學的蛋白質組學變化為突破口,研究內毒素血癥大鼠血清蛋白的表達變化及異丙酚對內毒素大鼠血清蛋白的影響。
　　 方法:蛋白質雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis,2

6、-DE)技術,特別是以固相pH梯度等電聚焦為第息量最大的電泳技術。到目前為止,雙向電泳仍然以它的高分辨率、高靈敏度以及新技術的引入(如窄pH梯度、熒光差異標記技術等)而在蛋白質組研究中占據相當重要的地位。
　　 功能蛋白質組學通過尋找不同生命過程或疾病過程狀態(tài)下出現(xiàn)的差異蛋白,從而找到與這些生命過程或病理過程功能相關的蛋白質集群。通過生物信息學(bioinformatics)的原理,我們可以根據結構域或模體將差異蛋白質組分為許多

7、功能子集,然后結合傳統(tǒng)的研究策略對子集進行深入研究。如能獲得足夠信息量的差異蛋白質組,就更能為發(fā)現(xiàn)這些蛋白質在細胞內相互聯(lián)系提供一個機遇。這樣的研究思路不但可以提高研究效率,使我們比較容易找到研究的切入點,也給我們的研究提供一個框架性的基礎,使我們通過對蛋白質功能網絡的解析,更好地去了解生命過程或生命現(xiàn)象這些較為宏觀的問題。
　　 在上述研究思路指導下,我們建立了2-DE聯(lián)合MS的蛋白質組學技術,最后用肽質量指紋圖譜(Pepti

8、de Mass Fingerprint,PMF)鑒定蛋白質,通過Westernbolt法和ELISA對所獲得的蛋白質進行行驗證,比較受不同刺激組下,內毒素血癥大鼠血清蛋白的表達譜。實驗分為三組:空白對照組:持續(xù)靜脈泵入10％脂肪乳；LPS刺激組:單次靜脈注射3 mg/kg LPS,LPS刺激+異丙酚處理組:單次靜脈注射3 mg/kg LPS后,以20 mg/kg/h持續(xù)靜脈泵入propofol。只有LPS刺激組出現(xiàn)上調或下調而LPS刺激

9、+異丙酚處理組出現(xiàn)與之相反趨勢的點才被選擇進行分析鑒定。這樣獲得的信息量將大大縮小并且更能準確反應這個過程中血清蛋白質的功能變化,結合生物信息學分析,將準確高效地發(fā)現(xiàn)內毒素血癥大鼠血清蛋白的表達變化及異丙酚對內毒素大鼠血清蛋白的影響。
　　 結果:2-DE分離并分析得到的差異點中,獲得有效鑒定的12種血清蛋白質中血小板因子-4 platelet factor 4(PF4)和主要尿蛋白前體(major urinaryprotein

10、 precursor)在LPS組表達量最高。而結合珠蛋白前體(haptoglobin precursor)、尿蛋白1前體(urinary protein 1 precursor)、載脂蛋白C-Ⅲ(apolipoprotein C-Ⅲ),C鏈區(qū)免疫球蛋白lambda-2 C鏈區(qū)(Ig lambda-2 chain C region),補體C3前體(complement C3 precursor)則在LPS刺激+異丙酚處理組中明顯下調。而白

11、蛋白a(parvalbumin alpha)表達量上調；中性粒細胞相關明膠酶載脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin precursor)的表達量,從對照組到LPS組再到LPS+異丙酚組表達量逐漸增高；另外與其他兩組相比,LPS組中的血紅蛋白亞基alpha-1/2(hemoglobin subunit alpha-1/2),血紅蛋白亞基beta-1(hemoglobin subuni

12、t beta-1)和peroxiredoxin-2表達量明顯下調。
　　 全身炎癥反應與凝血系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,在炎癥反應早期,由于LPS的刺激,凝血系統(tǒng)處于一個高凝狀態(tài),大量凝血物質被釋放,稱為DIC(disseminated intravascular coagulation)前期如果不能及時糾正,由于凝血因子的大量消耗,而最終導致凝血障礙,DIC形成。血小板因子4(PF4)是巨核細胞(M K)合成的,存在于白細胞、M K和

13、血小板A顆粒中的特異性熱穩(wěn)定蛋白,含有70個氨基酸,由4個單體組成,每個單體分子量為7.8KD。PF4屬人趨化因子超家族,C-X-C亞族,定位于人4號染色體長臂,其cDNA含有一個開放閱讀框架,羧基端含有肝素結合位點。生物活性包括:中和肝素；刺激白細胞彈性蛋白酶；趨化中性粒細胞、單核細胞和成纖維細胞；擬制內皮細胞的增殖、游走和血管的生成。PF4是在血小板被激活時釋放出來的一種促凝因子,是膿毒血癥早期導致血液高凝狀態(tài)的重要因子。在炎癥反應

14、過程中,PF4對中心粒細胞和單核細胞都具有趨化作用。因此我們首先選擇了PF4進行下一步驗證。我們主要通過westernblot和ELISA法對PF4進行了驗證,并對比了不同組間凝血酶原Ⅲ的活性及PT、APTT、TT、Fbg等變化,研究異丙酚對內毒素血癥大鼠凝血功能的改變。在正常對照組中PF4的表達基本看不見,而在LPS組PF4明顯增高,提示注射LPS6h后大鼠凝血系統(tǒng)被激活,處于一種高凝狀態(tài),而在LPS+異丙酚組中,PF4的表達在此降低

15、,提示在膿毒血癥早期,異丙酚能抑制由LPS誘導的PF4的釋放。
　　 結論:膿毒癥的發(fā)生過程中,可以產生大量的炎癥介質,包括細胞因子,趨化因子,補體等,這些炎癥介質可以激活內皮細胞促進粘附因子的表達,引起血小板的粘附和白細胞的滲出。本研究主要通過LPS刺激大鼠,以大鼠血清蛋白作為研究對象,通過蛋白質組學技術獲得了12種在不同刺激下有差異的蛋白質。其中的血小板因子4在凝血、炎癥和組織修復過程中具有重要作用,而異丙酚可以減少炎癥反應