肺泡巨噬細(xì)胞鉀離子通道在石英致細(xì)胞炎性反應(yīng)中的作用.pdf

1、吸入含游離二氧化硅的生產(chǎn)性粉塵可導(dǎo)致矽肺。至今矽肺發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前普遍認(rèn)為粉塵誘導(dǎo)的長(zhǎng)期持續(xù)的肺組織炎癥是矽肺的發(fā)病基礎(chǔ)。肺泡巨噬細(xì)胞（Alveolar Macropha ge，AM）是粉塵進(jìn)入支氣管肺泡后最主要的靶細(xì)胞，其與石英塵之間的相互作用是矽肺發(fā)病的關(guān)鍵，認(rèn)為是石英引起肺部炎性反應(yīng)的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。然而AM 在石英塵作用下的早期應(yīng)答機(jī)制仍不是很清楚。近年一些研究已經(jīng)確認(rèn)巨噬細(xì)胞鉀離子通道（Volta ge depende

2、nt potassium channel）與脂多糖作用下的細(xì)胞活化及隨后的功能應(yīng)答有關(guān)。鉀離子通道是細(xì)胞膜上的一種跨膜蛋白，不僅受細(xì)胞外刺激信號(hào)影響，還可通過膜電位改變傳遞信號(hào)至胞內(nèi)。AM 鉀離子通道是否可以作為早期跨膜信號(hào)參與粉塵誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)？據(jù)此本研究以AM 電壓依賴性鉀通道為研究對(duì)象，探討其在石英致細(xì)胞炎性反應(yīng)中的作用與意義。
　　 第一部分：大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜電壓依賴性鉀離子通道膜片鉗研究
　　 目的：

3、建立全細(xì)胞膜片鉗記錄模式及穿孔膜片鉗記錄模式，探討大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜電壓依賴性鉀通道的電生理特性，并比較這兩種記錄模式的異同。
　　 方法：SPF 級(jí)SD大鼠，支氣管肺泡灌洗法收集肺泡巨噬細(xì)胞，鋪種在裝有載玻片的24孔板內(nèi)，于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)2h后，取出玻片置于細(xì)胞池中。全細(xì)胞膜片鉗玻璃微電極用標(biāo)準(zhǔn)硼硅酸玻璃毛細(xì)管分兩步拉制而成，充灌內(nèi)液后入水阻抗在4～6MΩ；穿孔膜片鉗玻璃微電極用薄壁硼硅酸玻璃毛細(xì)管分兩步拉制而

4、成，充灌含制霉菌素的內(nèi)液后入水阻抗在2～4 MΩ。記錄模式建立后，在-160～60 mV 范圍內(nèi)給予持續(xù)時(shí)間500 ms、以20 mV 去極化躍遷的方波刺激。使用pClamp 9.0軟件進(jìn)行電流信號(hào)分析。鉀通道激活曲線用Boltzma nn方程：G/Gmax=1/{1+exp[ (V0.5-Vm)/k]}進(jìn)行擬合。
　　 結(jié)果：全細(xì)胞膜片鉗記錄模式和穿孔膜片鉗記錄模式均可記錄到AM 膜上電壓依賴性的內(nèi)向整流鉀電流及外向延遲鉀電流

5、。最大激活電壓下，全細(xì)胞膜片鉗記錄模式記錄到的外向延遲鉀電流密度為8.32±4.24 pA/pF，內(nèi)向整流鉀電流密度為-6.77±3.89pA/pF，相應(yīng)的半數(shù)激活電壓分別為-28.69±2.65 mV和-90.04±2.15 mV，斜率因子為28.27±1.27與19.57±2.14；穿孔膜片鉗記錄模式記錄到的AM 膜外向鉀電流密度為9.42±4.41 pA/pF，內(nèi)向鉀電流密度為-8.49±4.71 pA/pF，同比略大于全細(xì)胞記錄

6、結(jié)果，相應(yīng)的半數(shù)激活電壓分別為-15.38±2.30mV和-99.04±2.45mV，斜率因子為15.62±2.89和11.97±2.97，明顯不同于全細(xì)胞記錄模式所得參數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 全細(xì)胞膜片鉗記錄模式下膜電流在12 min開始有衰減現(xiàn)象，20 min內(nèi)幾乎衰減完全，穿孔膜片鉗記錄模式下膜電流沒有明顯衰減現(xiàn)象，最長(zhǎng)記錄時(shí)間可接近40 min。
　　 結(jié)論：(1)大鼠AM可表達(dá)電壓依賴性內(nèi)

7、向整流鉀電流和電壓依賴性外向延遲鉀電流兩種。這兩種電流的表達(dá)在巨噬細(xì)胞個(gè)體之間不同，綜合起來主要有三種類型：以外向延遲鉀電流為主，以內(nèi)向整流鉀電流為主，內(nèi)向與外向鉀電流表達(dá)皆明顯。
　　 (2)兩種記錄模式均可用于AM 電壓依賴性鉀通道的研究，但全細(xì)胞膜片鉗更適合短時(shí)大量的細(xì)胞記錄，而穿孔膜片鉗適合即時(shí)觀察毒物或藥物的作用。
　　 (3)全細(xì)胞膜片鉗記錄模式實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：電極選用標(biāo)準(zhǔn)壁厚的電極，入水阻抗控制在4～6 MΩ，

8、刺激電壓脈沖在-160～60 mV之間，記錄應(yīng)在破膜后10 min內(nèi)完成；
　　 穿孔膜片鉗記錄模式實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：電極選用薄壁電極，制霉菌素終濃度400 μg/ml，電極入水阻抗控制在2～4 MΩ間，刺激電壓脈沖在-160～60 mV之間，記錄時(shí)間不宜超過40 min。
　　 第二部分：石英顆粒對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞電壓依賴性鉀離子通道的影響
　　 目的：研究石英顆粒對(duì)大鼠AM 電壓依賴性鉀離子通道的影響及其動(dòng)力學(xué)變化

9、，探討AM 鉀離子通道在石英顆粒即時(shí)處理或長(zhǎng)時(shí)間（24 h）處理后的應(yīng)答變化。
　　 方法：AM 獲取與純化同第一部分，細(xì)胞鋪種于裝有載玻片的24孔板內(nèi)，濃度為1×105個(gè)/ml。向培養(yǎng)孔內(nèi)加入不同濃度的石英顆粒：0 μg/ml、25 μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200 μg/ml，及無定型石英顆粒100 μg/ml。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出進(jìn)行常規(guī)全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，記錄鉀電流變化。
　　 另取未經(jīng)任

10、何處理的AM 進(jìn)行穿孔膜片鉗實(shí)驗(yàn)。穿孔膜片鉗建立以后，通過灌流系統(tǒng)使細(xì)胞外液以2 ml/min的速度緩慢流過細(xì)胞池，用自制注射加樣系統(tǒng)在細(xì)胞池入口即時(shí)注入25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml的石英顆粒及100 μg/ml的無定型石英顆粒測(cè)試液，串聯(lián)刺激模式記錄細(xì)胞膜鉀通道的變化。不間斷記錄條件下即時(shí)加入石英顆粒，記錄受體依賴的陽離子或陰離子電流。
　　 細(xì)胞分離純化后鋪種在96孔板上，細(xì)胞濃

11、度調(diào)為5×105個(gè)/ml，依次加入0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)石英顆粒及100 μg/ml 無定型石英顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）漏出率及細(xì)胞成活率（MTT法）。
　　 結(jié)論：石英顆粒對(duì)AM外向延遲鉀通道有激活作用，使其開放概率增加，速率增加；
　　 對(duì)AM內(nèi)向整流鉀通道有激活作用，使其開放概率增加，速率增加，但長(zhǎng)時(shí)間處理激活

12、作用不明顯，石英顆粒不能以受體方式影響AM 電生理活性。提示AM 電壓依賴性鉀離子通道可能是石英顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞活化的早期信號(hào)蛋白之一，參與石英誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。
　　 第三部分：電壓依賴性鉀通道在石英致肺泡巨噬細(xì)胞活化及損傷中的作用
　　 目的：應(yīng)用電壓依賴性鉀通道阻斷劑和激活劑，研究大鼠AM 電壓依賴性鉀通道活性在石英顆粒誘導(dǎo)的AM活化、損傷和炎性介質(zhì)分泌等生物效應(yīng)的作用及意義。
　　 方法：肺泡灌洗法獲取SD大鼠

13、AM，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml 或1×106個(gè)/ml（用于TNF-α檢測(cè)）鋪種于96孔板內(nèi)，每孔200 μl。細(xì)胞純化后，將鉀通道阻斷劑四乙基銨（TEA，終濃度為2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mM）、4 氨基吡啶（4-AP，終濃度0.625 mM、1.25 mM、2.5 mM、5 mM）和激活劑K+（終濃度15 mM、30 mM、60 mM、120 mM）分別與100 μg/ml 石英顆粒同時(shí)處理AM，正常培養(yǎng)24

14、h后測(cè)定細(xì)胞LDH 漏出率、細(xì)胞存活率（MTT法），ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清液TNF-α含量。
　　 結(jié)論：AM 鉀離子通道與石英顆粒誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷及死亡有關(guān)，對(duì)石英顆粒誘導(dǎo)的AM TNF-α釋放有調(diào)節(jié)作用，可能是石英顆粒作用下的早期信號(hào)蛋白之一。
　　 第四部分：石英作用下肺泡巨噬細(xì)胞鉀離子通道與胞內(nèi)鈣的關(guān)系
　　 目的：應(yīng)用電壓依賴性鉀通道阻斷劑和激活劑，研究石英顆粒誘導(dǎo)下大鼠肺泡巨噬細(xì)胞電壓依賴性鉀通道與

15、胞內(nèi)鈣離子濃度的關(guān)系，探討粉塵誘導(dǎo)的細(xì)胞活化損傷信號(hào)機(jī)制。
　　 方法：SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞獲取與培養(yǎng)同第一部分。細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，均勻鋪種在載有玻片的6孔板中，每孔2 ml。細(xì)胞純化后，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用Fluo-3/AM 負(fù)載細(xì)胞30min后，置于激光掃描共聚焦顯微鏡上，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，放射波長(zhǎng)526 nm，記錄細(xì)胞熒光變化，掃描頻率為0.5 Hz。記錄基線平穩(wěn)后（約100 s），即時(shí)加入各處理組（100

16、μg/ml 石英顆粒組，100 μg/ml 無定型石英顆粒組，100 μg/ml 石英顆粒與20mM TEA組，100 μg/ml 石英顆粒與5 mM 4-AP組，100 μg/ml 石英顆粒與120 mM K+組），持續(xù)掃描記錄20 min。分析比較各組熒光強(qiáng)度變化。以未加樣時(shí)的鈣離子熒光強(qiáng)度作為基礎(chǔ)值，將加樣后的鈣離子熒光強(qiáng)度與之做比，得到標(biāo)化的鈣離子信號(hào)。
　　 結(jié)論：石英顆?？芍翧M 迅速啟動(dòng)鈣信號(hào)過程，而無定型石英顆粒