炎性反應在多壁碳納米管致胸膜間皮細胞惡性轉化中的作用.pdf

1、目的:
　　多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)是目前應用最為廣泛的新型納米纖維材料，在纖維特征和暴露方式上與石棉極其相似，故其對人體能否產生與石棉類似的危害效應受到高度關注?，F(xiàn)有研究表明，MWCNTs能誘導動物間皮瘤（2017年被國際癌癥研究機構列為2B類致癌物），對人類具有巨大的潛在威脅，但其作用機制不明;中國是MWCNTs的生產和消費大國之一。所以，研究MWCNTs致胸膜間

2、皮瘤的分子機制，可為更準確地評價其安全性，制定有效防治措施提供科學依據，無疑具有重要的科學意義和實際意義。
　　MWCNTs的炎性誘導作用是其目前較公認的主要毒效應機制之一，慢性炎癥是石棉致胸膜間皮瘤發(fā)生發(fā)展中的重要因素，胸膜腔持續(xù)的慢性炎癥也是MWCNTs致小鼠胸膜腔間皮瘤的顯著特征。所以，慢性炎癥在MWCNTs致胸膜間皮瘤過程中起什么作用，是通過何種途徑實現(xiàn)，成為闡明MWCNTs致胸膜間皮瘤分子機制的關鍵問題。但目前對慢性炎癥

3、在MWCNTs致胸膜間皮瘤作用機制研究中，存在以下問題:(1)動物實驗均采用高劑量、一次性注射的給藥方式。MWCNTs致胸膜間皮瘤是一個長期、低劑量持續(xù)作用過程，一次性注射在暴露途徑和暴露劑量上無法模擬MWCNTs的真實暴露情況。(2)體外實驗多采用單細胞培養(yǎng)，無法模擬胸膜腔內的細胞環(huán)境。認為只有基于真實暴露劑量和暴露環(huán)境的實驗體系，才有可能闡明MWCNTs致間皮瘤的分子機制。
　　本研究采用低劑量、長期染毒的作用模式，通過人胸膜

4、間皮細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)體系探討慢性炎性反應在MWCNTs致胸膜間皮細胞惡性轉化中的作用及其分子機制，以期為納米材料從業(yè)人員的職業(yè)安全防護提供科學依據，為間皮瘤的治療提供新的思路和借鑒。
　　方法:
　　本實驗分為四組，人胸膜間皮細胞組、巨噬細胞+人胸膜間皮細胞組、MWCNTs+人胸膜間皮細胞組和MWCNTs+巨噬細胞+人胸膜間皮細胞組;MWCNTs的終濃度為0.1μg/mL;作用時間為3個月;利用以下實驗進行研究:

5、　　1.通過掃描電鏡和透射電鏡來考察受試MWCNTs的纖維特征是否符合“病理性纖維”的前提條件;
　　2.通過比較不同組別間細胞因子的表達量變化，考察MWCNTs是否能誘導炎性反應以及間皮細胞與巨噬細胞之間的相互作用;
　　3.通過細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、克隆形成實驗、染色體畸變實驗和動物成瘤實驗，考察炎性細胞在MWCNTs致人胸膜間皮細胞惡性轉化中的作用;
　　4.通過轉錄組測序技術篩選MWCNTs致人胸膜間皮

6、細胞的惡性轉化中相關候選基因;并用qRT-PCR及western blot實驗技術對候選基因進行驗證，提出可能的分子作用機制;
　　5.構建候選基因穩(wěn)轉敲低的胸膜間皮細胞株，在MWCNTs作用下與巨噬細胞共培養(yǎng)后，通過比較不同組別之間細胞增殖、遷移、侵襲、克隆形成能力，考察候選基因在MWCNTs致間皮細胞惡性轉化中的作用;
　　6.構建候選基因穩(wěn)轉敲低的間皮細胞株，通過western blot技術檢測候選基因敲除的間皮細胞+

7、MWCNTs+巨噬細胞體系中間皮細胞的蛋白表達含量，確定基因之間相互作用關系。
　　結果:
　　通過以上實驗，得到了如下結果:
　　1.本實驗所用的MWCNTs平均長度范圍為10-20μm，管徑范圍為30-50nm，符合病理性纖維的特征。
　　2.MWCNTs作用于巨噬細胞可引起IL-1β細胞因子表達的顯著改變;巨噬細胞與間皮細胞之間存在密切聯(lián)系:MWCNTs作用于巨噬細胞所分泌的IL-1β能顯著增強間皮細胞IL

8、-8、TNF-α和IL-6等炎性因子的釋放。
　　3.在低劑量MWCNTs的長期作用下，體外培養(yǎng)的間皮細胞染色體畸變增加;MWCNTs+巨噬細胞+間皮細胞共培養(yǎng)體系中，間皮細胞染色體畸變率均高于其它組，差異具有統(tǒng)計學意義;此結果表明，低劑量的MWCNTs體外長期作用于間皮細胞可使其染色體畸變有增加的趨勢，巨噬細胞可能對MWCNTs致染色體畸變效應具有促進作用;
　　4.在低劑量MWCNTs的長期作用下，體外培養(yǎng)的間皮細胞發(fā)生

9、惡性轉化;MWCNTs+巨噬細胞+間皮細胞共培養(yǎng)體系中，間皮細胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力均明顯高于其它組，差異具有統(tǒng)計學意義;此結果表明:巨噬細胞對MWCNTs致間皮細胞的惡性轉化作用具有明顯的促進作用。
　　5.皮下接種MWCNTs+巨噬細胞+間皮細胞共培養(yǎng)體系中間皮細胞的裸鼠，其腫瘤體積和成瘤組織中細胞的Ki67陽性率明顯高于其它組，差異具有統(tǒng)計學意義;此結果提示與巨噬細胞共培養(yǎng)后的間皮細胞惡性轉化程度更高。
　　

10、6.通過轉錄組測序，篩選出一系列差異表達基因;結合前部分的研究結果，認為其中NF-κB(p65)，IL-6，STAT3基因與MWCNTs致間皮細胞惡性轉化關系最為密切;qRT-PCR及western blot實驗結果顯示，MWCNTs+巨噬細胞+間皮細胞共培養(yǎng)體系中間皮細胞的NF-κB(p65)，IL-6，STAT3基因和蛋白質表達量均明顯升高，與其他組比較差異具有統(tǒng)計學意義。以上結果提示:NF-κB(p65)，IL-6，STAT3基因

11、在MWCNTs致胸膜間皮細胞惡性轉化中發(fā)揮作用。
　　7.間皮細胞(sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬細胞共培養(yǎng)體系中，間皮細胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力均明顯低于間皮細胞(sh-NC)+MWCNTs+巨噬細胞組，差異具有統(tǒng)計學意義;此結果證明，NF-κB、IL-6、STAT3在MWCNTs致胸膜間皮細胞惡性轉化中發(fā)揮重要作用。
　　8.間皮細胞(sh-NC or sh-p

12、65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬細胞共培養(yǎng)體系中，敲低NF-κB(p65)后，IL-6、STAT3蛋白水平表達量均降低;敲低IL-6R后，NF-κB蛋白水平表達量不變，STAT3蛋白表達量降低;敲低STAT3后，NF-κB(p65)、IL6R蛋白表達量均不變。此結果表明在MWCNTs致胸膜間皮細胞的惡性轉化中存在NF-κB/IL-6/STAT3分子級聯(lián)，且NF-κB/IL-6/STAT3通路具有重

13、要作用。
　　結論:
　　通過上述研究，得出了以下結論:
　　1.MWCNTs刺激巨噬細胞所分泌的以IL-1β為主的細胞因子能顯著增強間皮細胞炎性因子的釋放;
　　2.在低劑量MWCNTs的長期作用下，體外培養(yǎng)的人胸膜間皮細胞可發(fā)生惡性轉化;
　　3.炎性反應可顯著促進MWCNTs致人胸膜間皮細胞的惡性轉化作用
　　4.NF-κB/IL-6/STAT3分子通路在炎性反應促MWCNTs致人胸膜間皮細胞的