氯離子通道在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)及其在細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，惡性度高，早期診斷困難，多數(shù)患者就診時已屬晚期，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌細(xì)胞具有高的增殖及轉(zhuǎn)移潛力，然而對其惡性生物學(xué)行為機(jī)制尚不明確。因此研究卵巢癌的惡性生物學(xué)行為機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，成為亟待解決的任務(wù)。 氯離子通道廣泛分布于有機(jī)體的細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜，其在細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)、物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞電位、細(xì)胞器的酸化、細(xì)胞增殖分化等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。氯離子通道在體內(nèi)的調(diào)

2、控受多種因素的的影響，根據(jù)功能及門控機(jī)制，氯通道可分為：電壓門控性氯離子通道（Voltage-gated chloride channels，CLC）、容積調(diào)控性氯離子通道（Volume-regulated/sensitive anion/chloride channels，VRAC）、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)體（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator， CFTR）、鈣激活性

3、氯離子通道（Calcium-activated chloride channels，CLCA）、配體激活的氯離子通道（ligand-activated chloride channels）。配體激活的氯通道主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)。氯離子通道參與多種細(xì)胞的增殖，氯通道阻滯劑對諸如肝細(xì)胞、肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖具有抑制作用。引人矚目的是：近年多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)氯離子通道在多種腫瘤中表達(dá)異常，并且氯通道可能在腫瘤細(xì)胞

4、的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中起著重要作用。例如：CLC氯通道在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中過表達(dá)，這有利于細(xì)胞大小和形狀的改變，從而導(dǎo)致瘤細(xì)胞易于分裂和侵襲狹窄的細(xì)胞外腦間隙；容積調(diào)控性氯離子通道是調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞通過G1期限制點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要因子；還有研究報道其在腫瘤細(xì)胞中呈細(xì)胞周期依賴性改變。CLC-3是CLC氯離子通道的重要家族成員，并且CLC-3又是容積調(diào)控性氯離子通道最有可能的候選蛋白，所以其功能復(fù)雜多樣，有研究報道前列腺

5、癌細(xì)胞中抗凋亡調(diào)節(jié)因子呈劑量依賴性上調(diào)CLC-3蛋白表達(dá)水平，使細(xì)胞生存能力提高而抗凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)抑制CLC-3蛋白表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低。 迄今為止，國內(nèi)外尚未見氯離子通道在卵巢上皮性癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對卵巢上皮性癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。因此我們研究的目的是觀察氯通道在卵巢上皮性癌細(xì)胞中的表達(dá)、探索氯離子通道在卵巢上皮性癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期中的作用以及CLC-3單通道改變對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。

6、 目的：觀察氯離子通道在卵巢上皮性癌細(xì)胞株A2780中的表達(dá)，探討氯離子通道在卵巢癌細(xì)胞株A2780增殖及細(xì)胞周期中的作用。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測幾種有代表性的氯離子通道m(xù)RNA在卵巢上皮性癌細(xì)胞中的基因表達(dá)；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測氯離子通道蛋白在A2780細(xì)胞中的表達(dá)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法，觀察不同濃度及種類的氯離子通道阻滯劑阻斷卵巢癌細(xì)胞氯離子通道后，卵巢癌細(xì)胞株A2780增殖活力的變

7、化；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測不同濃度及種類的氯離子通道阻滯劑阻斷卵巢癌細(xì)胞氯離子通道后，卵巢癌細(xì)胞A2780細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果：RT-PCR檢測提示卵巢癌細(xì)胞株A2780表達(dá)CLC-3及CFTR氯離子通道m(xù)RNA；但未檢測到hCLCA-2 mRNA表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示卵巢癌細(xì)胞A2780表達(dá)CLC-3及CFTR氯離子通道蛋白，蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)膜。MTT檢測表明不同濃度的氯通道阻滯劑NPPB、NFA、TAM作用細(xì)胞后明

8、顯抑制了A2780細(xì)胞的增殖活力。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的NPPB對A2780細(xì)胞的抑制率分別為23．4％、59．2％、90．8％及93．5％，各濃度組與對照組相比差異均有顯著性（P<0．05）。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的NFA對A2780細(xì)胞的抑制率分別為18．3％、40．9％、68．6％及75．1％，各濃度組與對照組相比差異均有顯著

9、性（P<0．05）。10μmol/L、20μmol/L及30μmol/L的TAM對A2780細(xì)胞的抑制率分別為65．8％、73．4％及77．5％，各濃度組與對照組相比差異均有顯著性（P<0．05）。而相對特異性CFTR氯通道阻滯劑Glibenclamide作用細(xì)胞后對A2780細(xì)胞的增殖活力無明顯影響。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的Glibenclamide對A2780細(xì)胞增殖的抑制率分別為

10、2．1％、2．8％、3．7％及3．9％，各濃度組與對照組相比，差異無顯著性（P>0．05）。 流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的氯離子通道阻滯劑NPPB、NFA、TAM作用A2780細(xì)胞72 h后，細(xì)胞周期的G0/G1和S期細(xì)胞分布均發(fā)生改變，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。而Glibenclamide作用A2780細(xì)胞后，細(xì)胞周期的G0/G1和S期細(xì)胞分布改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 1 NPPB對A2780細(xì)胞周期的影響50μmol/l

11、、100μmol/L及200μmol/L的NPPB作用于A2780細(xì)胞后：細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞數(shù)由55．4±2．1％分別增加到73．1±3．9％、84．2±2．3％及86．5±2．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。S期細(xì)胞數(shù)由34．0±2．5％分別下降至22．3±4．1％、12．1±2．3％及10．7±1．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。 2 NFA對A2780細(xì)胞周期

12、的影響50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的NFA作用于A2780細(xì)胞后：細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞數(shù)由55．4±2．1％分別增加到69．3±3．5％、74．6±2．1％及79．5±3．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。S期細(xì)胞數(shù)由34．0±2．5％分別下降至24．1±1．5％、18．7±1．9％及13．4±2．7％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。 3 TAM

13、對A2780細(xì)胞周期的影響10μmol/L、20μmol/L及30μmol/L的TAM作用于A2780細(xì)胞后：細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞數(shù)由55．4±2．1％分別增加到68．7±2．4％、73．8±3．3％及79．4±3．1％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。S期細(xì)胞數(shù)由34．0±2．5％分別下降至24．6±1．9％、20．3±2．2％及15．3±1．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。

14、 4 Glibenclamide對A2780細(xì)胞周期的影響50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的Glibenclamide作用于A2780細(xì)胞后：細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞數(shù)由55．4±2．1％分別改變?yōu)?5．8±2．9％、53．1±3．2％及54．2±3．5％，各濃度組與對照組相比差異均無顯著性（P>0．05）；S期細(xì)胞數(shù)由34．0±2．5％分別改變?yōu)?3．7±2．6％、36．9±1．6％及35．6±2．8％，

15、各濃度組與對照組比較差異均無顯著性（P>0．05）。 結(jié)論：CLC及CFTR氯離子通道在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780中表達(dá)。電壓門控性氯離子通道及容積調(diào)控性氯離子通道可能在卵巢上皮性癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期中起著重要作用。 目的：觀察電壓門控性氯離子通道-3（CLC-3）反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對卵巢上皮性癌細(xì)胞A2780增殖及細(xì)胞周期的影響。 方法：以脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)的CLC-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染卵巢上皮性癌

16、細(xì)胞株A2780，利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染CLC-3反義寡核苷酸后A2780細(xì)胞CLC-3蛋白表達(dá)的變化；通過MTT法、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的變化。應(yīng)用Western blot檢測CLC-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對卵巢癌細(xì)胞A2780細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）表達(dá)的影響。 結(jié)果：卵巢上皮性癌細(xì)胞A2780轉(zhuǎn)染CLC-3反義寡核苷酸后，CLC-3的蛋白表達(dá)明顯降低。50μg/ml和100μg/ml C