膠質(zhì)瘤中異檸檬酸脫氫酶基因的檢測及其對化療療效的影響.pdf

1、第一部分:膠質(zhì)瘤患者異檸檬酸脫氫酶基因突變的檢測及其臨床意義
　　 研究背景和目的:
　　 由星形細胞、少突膠質(zhì)細胞、室管膜細胞等神經(jīng)膠質(zhì)細胞起源的膠質(zhì)瘤是CNS最常見的惡性腫瘤，其生長部位、病理形態(tài)、基因遺傳學(xué)改變和治療效果有很大的差異性，通常依照其病理組織學(xué)類型分為低級別膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅱ級)和高級別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ～Ⅳ級）。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與正常腦組織界限不清，僅靠手術(shù)難以治愈，以最大程度上的手術(shù)切除為基礎(chǔ)，

2、結(jié)合放療和化療的綜合治療以延緩腫瘤復(fù)發(fā)和延長患者的生存期。盡管如此，WHOⅢ級膠質(zhì)瘤者生存期一般才2～3年，而WHOⅣ級如膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma，GBM)患者生存期僅為1年左右。膠質(zhì)瘤患者的病死率居高不下，使其成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Centralnervoussystem，CNS）最難攻克的腫瘤。令人慶幸的是，分子生物學(xué)的迅速發(fā)展給神經(jīng)腫瘤學(xué)研究帶來了一場深刻的變革，特別是膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究和臨床研究的所有領(lǐng)域。隨著人們對腫瘤

3、的分子遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)認識不斷提高，以及腫瘤分子流行病學(xué)、分子病理學(xué)等新興學(xué)科的建立，CNS腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲和血管形成的分子機制不斷被揭示，同時也為開發(fā)各種分子靶向治療藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。
　　 最新的突破發(fā)生在2008年，Parsons等學(xué)者為了鑒定GBM的基因遺傳學(xué)改變，對GBM的20661個蛋白的編碼基因進行測序，在世界上首次發(fā)現(xiàn)了異檸檬酸脫氫酶1的編碼基因(isocitratedehydrogenase1，I

4、DH1)突變存在于膠質(zhì)瘤中。實驗發(fā)現(xiàn)在149位GBM患者中有18位(12％)存在IDH1突變，且所有的IDH1突變都是發(fā)生在第四外顯子的Arg132(R132)的氨基酸序列上，該項成果發(fā)表在當(dāng)年的SCIENCE雜志上。BalssJ等在685例包含了各種類型不同病理級別的膠質(zhì)瘤中更大范圍研究了IDH1的R132突變。IDH1突變在膠質(zhì)瘤中頻繁發(fā)生，其在彌漫性星形細胞瘤(WHOⅡ級)中發(fā)生率為68％，而在繼發(fā)性GBM(Secondarygl

5、ioblastoma，sGBM)中發(fā)生率達到88％。此外，少突膠質(zhì)細胞瘤和少突膠質(zhì)星形細胞瘤中的IDHI突變發(fā)生率分別為69％和78％，而在毛細胞性星形細胞瘤(WHOⅠ級)中沒有檢測到IDH1/2突變。2009年新英格蘭雜志上發(fā)表了美國杜克大學(xué)HaiYan等的文章，研究者們在445個CNS腫瘤和494個非CNS腫瘤中進行了IDH1和IDH2的基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)IDH1突變不僅僅存在于WHOⅣ級GBM中，也廣泛存在于WHOⅡ級、Ⅲ級的星形

6、細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤中。在445個CNS腫瘤樣本中檢測到了161個IDH1的R132突變，在毛細胞性星形細胞瘤、室管膜下巨細胞瘤(WHOⅠ級)、室管膜瘤(WHOⅡ級)、髓母細胞瘤及其他非CNS腫瘤中均沒有檢測到IDH1突變。隨后膠質(zhì)瘤相關(guān)的IDH突變被的其他中心的一些學(xué)者相繼研究證實，揭示了IDH1/2突變與患者的年齡，病理類型以及臨床預(yù)后的關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)IDH突變與其他膠質(zhì)瘤分子標(biāo)記物比如TP53突變，表皮生長因子受體基因(Epit

7、helialgrowthfactorreceptorgene，EGFR)擴增，BRAFfusion基因，1p19q雜合性缺損以及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O(6)-methylguanineDNAmethyltransferase，MGMT)啟動子甲基化都有一定的相關(guān)性。
　　 但是在本實驗完成之前尚未有針對中國人群中膠質(zhì)瘤患者的IDH突變的相關(guān)報道。那么，在中國人群膠質(zhì)瘤患者中是否同樣存在IDH突變？其發(fā)生率與歐美國

8、家的研究結(jié)果是否有差異？IDH突變與膠質(zhì)瘤患者同步放化療(Concomitantchemoradiotherapy，CCRT)的療效有沒有關(guān)聯(lián)？本研究旨在通過聚合酶鏈反應(yīng)—高分辨率熔解分析方法和直接測序的方法檢測中國人群膠質(zhì)瘤患者IDH突變情況，并與國外文獻報道的結(jié)果進行比較。另外本研究也初步探討了IDH突變與膠質(zhì)瘤患者CCRT效果的關(guān)系。
　　 方法:
　　 研究對象
　　 收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科20

9、3例中國人群膠質(zhì)瘤患者的腫瘤標(biāo)本（包括各個WHO級別和不同的病理類型），所有的腫瘤標(biāo)本都取自本院病理科的石蠟包埋組織，而患者的臨床資料來自南方醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)的病歷記錄。所有腫瘤標(biāo)本均先經(jīng)兩位以上病理科醫(yī)生進行病理確認，取含有腫瘤細胞最多的部分組織做切片?；颊叩呐R床資料包括年齡、性別、病理診斷、健康狀況評分（WHO-performancescale，WHO-PS）、手術(shù)切除程度、術(shù)后輔助治療情況（放療、化療或者CCRT）、確診日期、手術(shù)

10、日期、復(fù)發(fā)日期、死亡日期、最后一次隨訪日期以及最后一次隨訪時患者的生存狀態(tài)。術(shù)后CCRT的方案是國際上的標(biāo)準(zhǔn)方案即Stupp方案:放療的整個療程應(yīng)同步化療，口服替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)75mg/m2，療程42d。放療結(jié)束后2-4周，輔助TMZ治療150mg/m2，連續(xù)用藥5天，28d為一個療程，若耐受良好，則在以后化療療程中增量至200mg/m2，推薦輔助TMZ化療6-12個療程。采用聚合酶鏈反應(yīng)—高分辨率熔解分析方

11、法及直接測序法檢測IDH1和IDH2突變情況，研究IDH突變與患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)處理
　　 所有統(tǒng)計學(xué)計算均使用SPSS13.0軟件完成。計數(shù)資料采用卡方檢驗進行差異性檢驗，獨立樣本T檢驗用來分析IDH突變陽性組和IDH突變陰性組的年齡差別。無進展生存期(Progression-freesurvival，PFS)和總體生存期(Overallsurvival，OS)用來反映患者的預(yù)后情況。PFS和OS用來反映患者的臨床

12、預(yù)后，兩者均以手術(shù)當(dāng)天為第一天開始計算，前者到患者病情進展確診的當(dāng)天結(jié)束，后者到患者死亡當(dāng)天或者最后一次隨訪結(jié)束（刪失數(shù)據(jù)）。應(yīng)用Kaplan-Meier法行生存分析、Log-rank法行顯著性檢驗以比較不同患者的生存差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。需要注意的是，高級別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后2周之內(nèi)死亡或<參考文獻>=者低級別膠質(zhì)瘤患者術(shù)后2月之內(nèi)死亡不納入生存分析中，因為其死亡可能是手術(shù)的并發(fā)癥所致，不是疾病的自然進程。
　　

13、 結(jié)果:
　　 203例膠質(zhì)瘤患者中（包括WHOⅠ級5例:毛細胞型星形細胞瘤5例;WHOⅡ級86例:節(jié)細胞膠質(zhì)瘤4例，彌漫性星形細胞瘤60例，少突膠質(zhì)細胞瘤8例，少突膠質(zhì)星形細胞瘤14例;WHOⅢ級67例:間變性星形細胞瘤49例，間變性少突膠質(zhì)星形細胞瘤11例，間變性少突膠質(zhì)細胞瘤7例;WHOⅣ級45例:pGBM38例，sGBM7例）有80例存在IDH突變，其中IDH1突變75例(36.9％)、IDH2突變5例(2.5％)。沒有

14、一例樣本同時存在IDH1和IDH2兩種突變。IDH突變型患者較IDH野生型患者年齡更年輕，手術(shù)的全切率更高。分組討論中（主要分為:除外WHOⅠ級毛細胞型星形細胞瘤的整體組，WHOⅡ級無術(shù)后輔助治療亞組，WHOⅢ級術(shù)后行CCRT亞組），無論是在除外5例WHOⅠ級患者的總體上比較(P＜0.001)，還是在WHOⅡ級無術(shù)后輔助治療的患者組(P=0.014)以及在WHOⅢ級術(shù)后行CCRT組內(nèi)(P=0.033)比較，IDH突變陽性患者的OS比ID

15、H突變陰性患者的OS長。另外在WHOⅢ級術(shù)后行CCRT組，IDH突變與CCRT療效無相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 IDH突變同樣廣泛存在于中國人群膠質(zhì)瘤患者中（WHOⅡ～Ⅲ級的膠質(zhì)瘤以及WHOⅣ級的sGBM），但IDH1突變率卻稍低于歐美國家研究中心的報道，IDH1/2的突變類型也少于以往國外的報道。本組數(shù)據(jù)也再次證實了IDH突變型患者預(yù)后相對IDH野生型患者較好，但是IDH突變在間變性膠質(zhì)瘤中與患者術(shù)后CCRT的療效無

16、相關(guān)性。
　　 第二部分:異檸檬酸脫氫酶基因突變在繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中與替莫唑胺療效的關(guān)系
　　 研究背景和目的:
　　 GBM是成年人中最常見、惡性程度最高的腦腫瘤，也是惡性膠質(zhì)瘤中最常見的類型（約一半以上），其年發(fā)病率約3-5/10萬人，可發(fā)生在任何年齡段，最常發(fā)生在老年人（年齡的中位數(shù)為64歲，sGBM患者發(fā)病年齡要稍年輕，年齡的中位數(shù)為45歲），很少發(fā)生在兒童患者。GBM具有很高的致殘和致死率，嚴(yán)重威脅人

17、類健康，而其治療前景至今仍然不容樂觀。即使經(jīng)過最大程度上的手術(shù)切除和術(shù)后規(guī)范的CCRT，GBM患者的中位PFS和OS也僅僅只有7個月和15個月。GBM呈浸潤性生長，具有特征性的病理組織學(xué)特點和影像學(xué)特點。90％以上的GBM是原發(fā)性的（PrimaryGlioblastomamultiforme，pGBM），進展很快，病程從幾天到幾周不等。約10％的GBM是繼發(fā)性的，是由WHOⅡ或Ⅲ級膠質(zhì)瘤逐漸進展而來。pGBM和sGBM雖然在病理組織學(xué)上

18、很難區(qū)分，但是兩者具有截然不同的分子生物學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近幾年來越來越多的研究結(jié)果表明IDH1和IDH2突變廣泛存在于sGBM中。
　　 在GBM中MGMT啟動子甲基化不僅僅是患者臨床預(yù)后的良性指標(biāo)，更是預(yù)測TMZ療效的敏感指標(biāo)。而在間變性膠質(zhì)瘤中，MGMT啟動子甲基化僅僅是一個良性預(yù)后指標(biāo)，與TMZ的療效無關(guān)。事實上MGMT啟動子甲基化作為預(yù)測TMZ療效的敏感指標(biāo)主要是針對于新診斷的GBM，而新診斷的GBM中約90％是原發(fā)性，繼發(fā)

19、性的只占到10％左右。然而如前所述，pGBM和sGBM雖然在病理組織學(xué)上很難區(qū)分，但是兩者發(fā)病的分子生物學(xué)機制截然不同，因此很難說MGMT啟動子甲基化在sGBM中扮演著同樣的角色。另外在sGBM中，MGMT啟動子甲基化往往和IDH1/2突變同時存在，而IDH1/2也是膠質(zhì)瘤患預(yù)后的強有力的預(yù)測指標(biāo)，那么在sGBM患者臨床預(yù)后方面，MGMT啟動子甲基化與IDH1/2的關(guān)系如何？孰輕孰重？還有在sGBM患者中，在TMZ療效方面，MGMT啟動

20、子甲基化與IDH1/2的關(guān)系又如何？我們查閱國內(nèi)外文獻，尚沒有這方面的報道。本研究目的是探討IDH突變對sGBM患者TMZ化療臨床預(yù)后的影響，以及與其他分子標(biāo)記物如p53表達、MGMT啟動子甲基化、1p19q雜合性缺失的關(guān)系。
　　 方法:
　　 研究對象:
　　 收集2003年1月至2009年12月經(jīng)手術(shù)證實的sGBM86例，分別檢測IDH1/2突變、1p19q雜合性缺失、MGMT啟動子甲基化和p53表達，利用

21、生存分析比較這些指標(biāo)與患者臨床預(yù)后（即PFS和OS）的關(guān)系。反映TMZ療效的主要指標(biāo)是用藥后的患者PFS和腫瘤大?。ㄍㄟ^定期的頭顱磁共振檢查來反映）。統(tǒng)計學(xué)處理
　　 各項分子標(biāo)記物指標(biāo)之間的相關(guān)性以及各項分子標(biāo)記物指標(biāo)與TMZ療效（主要是通過影像學(xué)上的改變來反映）的關(guān)系用卡方檢驗（其中多重比較用Bonferroni檢測法）。獨立樣本T檢驗用來分析IDH突變陽性組和IDH突變陰性組的年齡差別。PFS和OS用來反映患者的臨床預(yù)后，

22、兩者均從使用TMZ的第一天開始計算，前者到患者病情進展確診的當(dāng)天結(jié)束，后者到患者死亡當(dāng)天或者最后一次隨訪結(jié)束（刪失數(shù)據(jù)）。應(yīng)用Kaplan-Meier法行生存分析、Log-rank法行顯著性檢驗以比較不同患者的生存差異。進行多變量分析以了解各因素對生存期的影響，本研究中使用Cox比例風(fēng)險回歸模型來估計風(fēng)險比(HR)，并計算95％可信區(qū)間(CI)和P值，運用逐步回歸法進行各因素的篩選及最優(yōu)模型的建立。以上統(tǒng)計學(xué)方法均采用雙尾檢驗，檢驗水準(zhǔn)

23、α取0.05，數(shù)據(jù)的分析均采用SPSS13.0版本。
　　 結(jié)果:
　　 79例患者中有58例存在IDH1或者IDH2突變（突變率73.4％，7例腫瘤樣本無法檢測）。IDH突變、MGMT啟動子甲基化以及1p19q雜合性缺失均與患者的PFS呈正相關(guān)。IDH突變陽性或者MGMT啟動子甲基化的患者對TMZ的療效更好，主要反映在相同的時間內(nèi)腫瘤體積的縮小更明顯。IDH突變陽性和MGMT甲基化同時存在的患者，TMZ治療的效果最好。