E1A激活基因阻遏子基因調(diào)控血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其機(jī)制研究.pdf

1、傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為病理性血管重構(gòu)的發(fā)生是一個(gè)“由內(nèi)而外”的過(guò)程,由內(nèi)管內(nèi)皮細(xì)胞損傷始動(dòng),繼而血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖,并合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)蛋白,最終導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。然而,通過(guò)抑制內(nèi)皮損傷和對(duì)抗VSMCs增殖來(lái)進(jìn)行的治療性研究并沒(méi)有完全阻斷病理性血管重構(gòu)的發(fā)生。近年來(lái),血管外膜在血管重塑中的作用越來(lái)越受到人們的重視,并

2、且提出“由外而內(nèi)”的血管損傷重構(gòu)假說(shuō),其中心觀點(diǎn)認(rèn)為血管損傷發(fā)生后,外膜是血管壁的第一感知部位。無(wú)論血管損傷是否累及外膜(嚴(yán)重與否),對(duì)損傷反應(yīng)活躍的細(xì)胞最先出現(xiàn)于血管外膜。血管外膜成纖維細(xì)胞(adventitialfibroblasts,AFs)是血管外膜中最主要的細(xì)胞成分,其在各種病理性損傷刺激下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts,MFs),MFs是一種具有平滑肌細(xì)胞特征的成纖維細(xì)胞,表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(smoot

3、hmuscleα-actin,α-SMA),可以產(chǎn)生ECM和多種生物活性因子,MFs增殖并遷移至中膜和內(nèi)膜,參與新生內(nèi)膜形成及血管重塑過(guò)程。
　　E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的血管穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子,其在成熟分化的組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá),但在去分化組織或細(xì)胞,如鼠胚胎干細(xì)胞、人畸胎瘤細(xì)胞、造血干細(xì)胞和去分化表型VSMCs中卻呈明顯低表達(dá)或無(wú)表達(dá)

4、狀態(tài)。CREG可直接與外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合在靶基因的啟動(dòng)子上,從而阻遏E1A和E2F對(duì)靶基因的激活作用,因而推測(cè)CREG可能通過(guò)與E1A、E2F競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用而起到促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn),在無(wú)特異性誘導(dǎo)劑存在的情況下,CREG仍可以單獨(dú)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的畸胎瘤細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。另外,CREG還具有維持心肌細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞成熟穩(wěn)態(tài)、對(duì)抗病理性細(xì)胞損傷發(fā)生的生物學(xué)功能。本

5、實(shí)驗(yàn)室前期系列研究證實(shí),CREG基因在成熟分化的VSMC中大量表達(dá),能夠維持VSMC分化、阻遏在體損傷后VSMC向去分化表型轉(zhuǎn)化并抑制新生內(nèi)膜形成。因此,CREG是參與維持組織及細(xì)胞成熟分化穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控因子。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物體內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過(guò)程。在哺乳動(dòng)物

6、細(xì)胞中MAPKs亞族主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Junamino-terminalkinase1/2,JNK1/2)和p38-MAPK。我們研究室前期在研究CREG調(diào)控人VSMCs凋亡過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn),CREG過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制JNK1/2和p38-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來(lái)阻止藥物誘導(dǎo)的離體培養(yǎng)的人VSMC

7、s凋亡,同時(shí),外源性添加CREG蛋白也能夠抑制JNK1/2和p38-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來(lái)緩解球囊損傷誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈血管中VSMCs的凋亡。另外,關(guān)于CREG基因的其他研究小組也相繼證實(shí),CREG抑制心肌肥厚、纖維化和炎癥作用的機(jī)制與ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。綜上所述,CREG可作為MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游調(diào)控子來(lái)影響多種組織細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　本研究擬在整體和細(xì)胞兩個(gè)水平復(fù)制AFs細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化模型,運(yùn)用形

8、態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù),圍繞血管損傷后CREG基因表達(dá)對(duì)血管外膜增生、AFs細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,以及MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中發(fā)揮的調(diào)控作用等方面的問(wèn)題進(jìn)行研究,以期通過(guò)闡明CREG基因?qū)Fs細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用及其機(jī)制,為拓展防治血管重塑性疾病的新思路奠定基礎(chǔ)。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.CREG基因表達(dá)與AFs表型轉(zhuǎn)化間的相關(guān)性研究。
　　采用小鼠頸動(dòng)脈血管損傷模型,免疫熒光染色觀察

9、血管損傷后外膜中α-SMA表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-SMA僅在正常血管中膜表達(dá),外膜沒(méi)有表達(dá),損傷1d后血管外膜開始增生,并有少量α-SMA表達(dá),提示開始有AFs轉(zhuǎn)化為MFs,損傷3d后血管外膜增生最明顯,α-SMA在外膜中大量表達(dá),而在損傷7d和14d后,外膜增生程度有所緩解,α-SMA的表達(dá)也逐漸減少;正常血管外膜大量表達(dá)CREG蛋白,損傷1d后CREG在外膜中的表達(dá)開始減少,損傷3d后外膜中幾乎沒(méi)有CREG表達(dá),而在損傷7d和14d

10、后CREG在血管外膜中的表達(dá)逐漸恢復(fù)。由此可見,損傷血管外膜中CREG的表達(dá)變化與α-SMA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　采用貼壁法培養(yǎng)C57BL/6小鼠胸主動(dòng)脈AFs,免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的類型,發(fā)現(xiàn)其胞膜上不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VIII因子,胞漿內(nèi)也不表達(dá)VSMCs標(biāo)志物desmin和α-SMA,但表達(dá)波形蛋白(vimentin),說(shuō)明細(xì)胞是間質(zhì)性來(lái)源,同時(shí)排除內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs的參雜,可以確定培養(yǎng)的細(xì)胞為AFs。<

11、br>　　采用血管緊張素II(angiotensinII,AngII)作為誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑,觀察AngII誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中CREG表達(dá)變化。Western-Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),給予不同濃度AngII(0、10nM、100nM、1μM和10μM)刺激24h或者給予1μMAngII刺激不同時(shí)間(0h、12h、24h、48h、72h、96h和120h)后,AFs表達(dá)α-SMA逐漸增多,并且表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性特點(diǎn);同時(shí),1μ

12、M和10μMAngII刺激24h后,AFs中CREG的表達(dá)量分別減少45.5％(p<0.01)和75.8%(p<0.01);AngII刺激后CREG的表達(dá)變化也表現(xiàn)為時(shí)間依賴性,1μMAngII刺激24h后CREG的表達(dá)減少31.5%(p<0.01),隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),CREG表達(dá)量逐漸減少,至120h后減少達(dá)98.9%(p<0.01)。應(yīng)用AngII1型受體阻斷劑EMD66684(10μM),AngII誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化及CREG表

13、達(dá)下調(diào)的作用消失,而應(yīng)用AngII2型受體阻斷劑PD123319(10μM)對(duì)AngII誘發(fā)的AFs表達(dá)α-SMA增加和表達(dá)CREG減少現(xiàn)象無(wú)影響,說(shuō)明AngII通過(guò)與其1型受體相互作用誘導(dǎo)AFs轉(zhuǎn)化為MFs,同時(shí)下調(diào)細(xì)胞中CREG的表達(dá)。
　　以上在體和離體實(shí)驗(yàn)均表明,AFs表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中CREG表達(dá)下調(diào),提示CREG基因表達(dá)可能與AFs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。
　　2.CREG基因過(guò)表達(dá)抑制AngII誘導(dǎo)的AFs表型轉(zhuǎn)化。

14、　　采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染法制備CREG基因過(guò)表達(dá)的小鼠原代AFs模型,應(yīng)用AngII(1μM,24h)誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化,免疫熒光染色結(jié)果顯示,AngII誘導(dǎo)正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組中AFs表達(dá)α-SMA增多,而CREG基因過(guò)表達(dá)組能夠?qū)笰ngII誘導(dǎo)的AFs表型轉(zhuǎn)化。Western-blot結(jié)果表明,應(yīng)用AngII刺激后AFs中表達(dá)α-SMA明顯增多(與正常對(duì)照組相比,719.4%±7.5%,p<0.01,n=3),但表達(dá)CREG明顯減

15、少(與正常對(duì)照組相比,67.6%±5.5%,p<0.05,n=3),CREG基因過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)AFs中CREG的表達(dá)(與Ad-GFP+AngII刺激組相比,220%±4.8%,p<0.01,n=3),同時(shí)抑制AngII誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)增多(與Ad-GFP+AngII刺激組相比,21.6%±4.7%,p<0.01,n=3)。以上提示CREG基因過(guò)表達(dá)可以抑制AngII誘導(dǎo)的AFs表型轉(zhuǎn)化。
　　AFs受到AngII刺激后轉(zhuǎn)化為M

16、Fs,同時(shí)其增殖和遷移能力增強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CREG具有調(diào)控AFs表型轉(zhuǎn)化的作用,我們分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU免疫組化染色和流式細(xì)胞周期分析的方法,檢測(cè)CREG基因過(guò)表達(dá)對(duì)AngII誘導(dǎo)的AFs增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):腺病毒載體介導(dǎo)CREG基因轉(zhuǎn)染AFs后2~4dCREG蛋白表達(dá)水平明顯升高(與未轉(zhuǎn)染組相比,2d,197.6%±33.5%,p<0.05,n=3;3d,482.7%±90.6%,p<0.01,n=3;4d,269.6%±

17、52.4%,p<0.01,n=3),CREG基因轉(zhuǎn)染后2~5d,AngII誘導(dǎo)的AFs增殖被顯著抑制(與Ad-GFP+AngII刺激組相比,2d,66.7%±9.7%,p<0.05,n=3;3d,63.3%±7.1%,p<0.01,n=3;4d,71.2%±5.4%,p<0.01,n=3;5d,77.5%±6.6%,p<0.01,n=3),CREG基因轉(zhuǎn)染后6~12d,AFs增殖情況與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異;BrdU免疫組化染色顯示,應(yīng)用

18、AngII(1μM,24h)刺激后,BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯升高,而CREG基因過(guò)表達(dá)可顯著降低BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例(正常對(duì)照組為12.5%±7.3%,AngII處理組為76.3%±9.7%,Ad-GFP+AngII處理組為70.9%±11.4%,Ad-CREG+AngII處理組為22.6%±6.8%;AngII處理組與正常對(duì)照組相比,p<0.01,n=3;Ad-CREG+AngII處理組與Ad-GFP+AngII處理組相比,p<0

19、.01,n=3);流式細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),應(yīng)用AngII(1μM,24h)刺激后,G0/G1期細(xì)胞百分比明顯降低,進(jìn)入S期細(xì)胞比例明顯升高,而CREG基因過(guò)表達(dá)可顯著抑制AFs由G0/G1期進(jìn)入S期(正常對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞百分比為54.9%±6.3%,S期細(xì)胞百分比為2.4%±2.2%;AngII處理組G0/G1期細(xì)胞百分比為41.8%±2.9%,S期細(xì)胞百分比為27.1%±5.4%;Ad-GFP+AngII處理組G0/G1期細(xì)胞百分

20、比為43.1%±5.8%,S期細(xì)胞百分比為26.3%±4.3%;Ad-CREG+AngII處理組G0/G1期細(xì)胞百分比為50.5%±4.5%,S期細(xì)胞百分比為6.3%±4.3%;AngII處理組與正常對(duì)照組相比,p<0.01,n=4;Ad-CREG+AngII處理組與Ad-GFP+AngII處理組相比,p<0.01,n=4)。上述研究結(jié)果提示CREG基因過(guò)表達(dá)可抑制AngII誘導(dǎo)的AFs增殖。
　　接下來(lái),我們分別采用劃痕實(shí)驗(yàn)和T

21、ranswell細(xì)胞遷移模型檢測(cè)CREG基因過(guò)表達(dá)對(duì)AngII誘導(dǎo)的AFs遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在AngII的趨化作用下,AFs遷移活性明顯增強(qiáng),表現(xiàn)為劃痕區(qū)域的細(xì)胞覆蓋數(shù)目增加(1μMAngII,24h),遷移至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)目增多(1μMAngII,6h),而CREG基因過(guò)表達(dá)明顯減少劃痕區(qū)域的細(xì)胞覆蓋數(shù)目(進(jìn)入無(wú)細(xì)胞區(qū)的細(xì)胞數(shù):正常對(duì)照組為21±5個(gè),AngII處理組為47±4個(gè),Ad-GFP+AngII處理組為5

22、0±7個(gè),Ad-CREG+AngII處理組為33±5個(gè);AngII處理組與正常對(duì)照組相比,p<0.01,n=3;Ad-CREG+AngII處理組與Ad-GFP+AngII處理組相比,p<0.01,n=3)和Transwell下室細(xì)胞數(shù)目(正常對(duì)照組為16.5±2.5個(gè),AngII處理組為44.2±5.5個(gè),Ad-GFP+AngII處理組為47.4±4.8個(gè),Ad-CREG+AngII處理組為25.7±4.2個(gè);AngII處理組與正常對(duì)照