細(xì)胞內(nèi)鈣超載在腺苷(Adenosine)致肝癌細(xì)胞凋亡作用機制研究.pdf

1、研究目的:
　　探討腺苷(Adenosine,ADO)誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其與Ca2+相關(guān)的機制。
　　材料和方法:
　　HepG2細(xì)胞培養(yǎng)后按以下方法進(jìn)行實驗:
　?、貱CK-8法檢測細(xì)胞增殖活性:細(xì)胞傳代至96孔板中,待細(xì)胞貼壁后分別用含不同濃度ADO(0-6.0mmol/L)的培養(yǎng)基處理HepG2細(xì)胞24h、36h及48h,然后利用CCK-8法測定ADO對HepG2細(xì)胞增殖活性的效應(yīng)。
　　

2、②DAPI染色檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞傳代至蓋玻片上,待細(xì)胞貼壁后將HepG2細(xì)胞暴露于不同濃度的ADO(0-4.0mmol/L)作用24h,DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變。
　?、跘nnexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率:細(xì)胞貼壁后加入正常培養(yǎng)基(空白組和對照組)及ADO(處理組)作用細(xì)胞24h,流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　?、蹻ura-2AM及Fluo-4AM檢測細(xì)胞內(nèi)游離Ca2

3、+濃度:ADO處理組與正常對照組培養(yǎng)細(xì)胞24小時后,分別用熒光分光光度法檢測Fura-2AM染色及共聚焦顯微鏡下檢測Fluo-4AM染色,比較ADO處理前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　⑤熒光定量PCR(RT-q PCR)檢測相關(guān)因子mRNA表達(dá):提取ADO(0-4.0mmol/L)作用24h后細(xì)胞總RNA,RT-qPCR法檢測凋亡相關(guān)通路m-calpain,Caspase-4,Bax,Bak及Caspase-3的mRNA水平的表達(dá)

4、;
　　⑥免疫印跡法檢測蛋白表達(dá):ADO(0-4.0mmol/L)處理HepG2細(xì)胞24h,提取細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測上述通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　⑦通過羅丹明123(Rho123)染色ADO處理前后的HepG2細(xì)胞利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ADO(0-4.0mmol/L)處理24h前后細(xì)胞線粒體膜電位(ΔΨm)變化。
　　結(jié)果:
　　1、觀察不同濃度ADO分別處理HepG2細(xì)胞24h、36h及48h

5、后對其細(xì)胞的增殖抑制作用:CCK-8法檢測結(jié)果顯示,隨ADO濃度增加或作用時間延長,ADO處理組吸光值(OD值)減少,與對照組相比,差異有顯著性(P<0.05),表明ADO抑制了肝癌HepG2細(xì)胞增殖。
　　2、不同濃度的ADO作用HepG2細(xì)胞24h后,熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后細(xì)胞核形態(tài),正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形,淡藍(lán)色;ADO處理后,染色質(zhì)凝固、凝集,有典型的“凋亡小體”出現(xiàn),這種凋亡特征的細(xì)胞呈劑量依賴性增加。
　

6、　3、Annexin V-FITC/PI雙熒光染色流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,隨著ADO處理劑量的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸升高,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性關(guān)系,表明ADO是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖。
　　4、分別用熒光分光光度法及共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,結(jié)果表明不同濃度的ADO(0-4.0mmol/L)處理HepG2細(xì)胞24h后,Fura-2AM染色后顯示細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度呈上升趨勢(F340/F380比值升高,差異有顯著性,

7、P<0.05);Fluo-4AM染色后于共聚焦顯微鏡下可檢測到細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯升高。
　　5、RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,不同濃度的ADO(1.0-4.0mmol/L)處理HepG2細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)鈣依賴蛋白m-calpain、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白Caspase-4、Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bak及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達(dá)上升;與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。<

8、br>　　6、流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位(ΔΨm)結(jié)果表明,與對照組相比,隨著ADO濃度增加,ΔΨm顯著下降(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、ADO能抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。
　　2、在此過程中,ADO可提高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平,激活鈣依賴蛋白m-calpain,Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bak,Caspase-4及Caspase-3,并伴有線粒體膜電位降低。鈣穩(wěn)態(tài)失衡后活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激