Sirtuin3在心肌細(xì)胞鈣超載時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究外源性Sirtuin3在H9c2心肌細(xì)胞鈣超載時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響以及可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　將培養(yǎng)好的H9c2心肌細(xì)胞株隨機(jī)分為4組：1組，對(duì)照組（control group）；2組，Sirtuin3組（Sirtuin3 group）；3組，ionomycin組（ionomycin group）；4組，ionomycin聯(lián)合Sirtuin3組（ionomycin&Sirtuin3 group）

2、。其中3組，4組采用ionomycin誘導(dǎo)法構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞鈣超載模型。
　　采用分光光度法檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i）；采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）檢測各組心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)和胞質(zhì)中細(xì)胞色素C（Cyt C）的蛋白表達(dá)；采用Western blot檢測各組心肌細(xì)胞胞質(zhì)中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的蛋白表達(dá)；采用分光光度法檢測各組心肌細(xì)胞中caspase-3的活性；采用流

3、式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測各組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡比率。
　　結(jié)果：
　　測得各組心肌細(xì)胞[Ca2+]i分別為（nmol/L）：112.31±20.12，110.28±19.83，374.82±26.29，186.45±23.14。與對(duì)照組相比，Sirtuin3組[Ca2+]i無明顯改變（P>0.05），ionomycin組[Ca2+]i明顯增高（P<0.05）；而ionomycin聯(lián)合Sir

4、tuin3組[Ca2+]i較ionomycin組明顯減少（P<0.05）。提示使用ionomycin誘導(dǎo)法可以成功構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞鈣超載模型，而經(jīng)過外源性Sirtuin3處理心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載明顯減輕。
　　Western blot檢測Cyt C的結(jié)果（1）各組心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的Cyt C蛋白表達(dá)結(jié)果比較：與對(duì)照組相比，Sirtuin3組無明顯改變（P>0.05）， ionomycin組明顯低于對(duì)照組（P<0.05），ionom

5、ycin聯(lián)合Sirtuin3組明顯高于ionomycin組（P<0.05）；（2）各組心肌細(xì)胞胞質(zhì)中Cyt C的蛋白表達(dá)比較：與對(duì)照組相比，Sirtuin3組無明顯改變（P>0.05）， ionomycin組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），ionomycin聯(lián)合Sirtuin3組明顯低于ionomycin組（P<0.05）。
　　Caspase-3的檢測結(jié)果（1）Western blot結(jié)果顯示caspase-3在胞質(zhì)中的蛋白表達(dá)

6、比較：與對(duì)照組相比，Sirtuin3組無明顯改變（P>0.05）， ionomycin組明顯高于對(duì)照組（P<0.05），ionomycin聯(lián)合Sirtuin3組caspase-3的表達(dá)明顯低于ionomycin組（P<0.05）；（2）分光光度法檢測各組caspase-3活性分別為（nmol/h）：1.231±0.13，1.128±0.19，4.825±0.21，2.253±0.23。與對(duì)照組相比，Sirtuin3組caspase-3活

7、性無明顯改變（ P>0.05）， ionomycin組中 caspase-3活性高于對(duì)照組（ P<0.05）， ionomycin聯(lián)合 Sirtuin3組明顯低于 ionomycin組（P<0.05）。
　　各組心肌細(xì)胞凋亡比率（雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)）結(jié)果分別為：(29.22±0.3)％，(28.30±0.2)%，(67.24±0.5)%，(38.78±0.7)%。Sirtuin3組的凋亡比率與對(duì)照組相比無明顯差異（P>0.05）