Eya1調(diào)節(jié)CyclinD1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 目的:探討蛋白Eya1在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用。
　　 方法:選用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474以及MDA-MB-231 作為研究對象。首先，在MDA-MB-453，SK-BR3以及BT474細(xì)胞系中采用慢病毒感染的方式穩(wěn)定高表達(dá)蛋白Eya1，Eya1磷酸酶突變體Eya1D327A以及相應(yīng)的空質(zhì)粒對照；而在MDA-MB-231細(xì)胞系中，通過感染Eya1的shRNA(small

2、hairpin RNA)慢病毒，從而獲得穩(wěn)定低表達(dá)蛋白Eya1的MDA-MB-231細(xì)胞系以及相應(yīng)的空質(zhì)粒對照。然后，在以上的高表達(dá)或者低表達(dá)蛋白Eya1細(xì)胞系中，通過MTT，細(xì)胞生長曲線，H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法以及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Eya1對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 結(jié)果:首先在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Eya1，Eya1磷酸酶突變體Eya1D327A

3、以及相應(yīng)的空質(zhì)粒對照的穩(wěn)定細(xì)胞株。然后，通過MTT比色法，細(xì)胞生長曲線檢測Eya1對細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MDA-MB-453細(xì)胞中，與空質(zhì)粒對照相比，高表達(dá)Eya1后細(xì)胞增殖能力是空質(zhì)粒組的1.5倍，而高表達(dá)Eya1磷酸酶突變體Eya1D327A組細(xì)胞無明顯增殖優(yōu)勢。同樣，在SK-BR3細(xì)胞中，與空質(zhì)粒對照相比，高表達(dá)Eya1后細(xì)胞增殖能力是空質(zhì)粒組的2倍，而高表達(dá)Eya1磷酸酶突變體Eya1D327A組細(xì)胞無明顯增殖

4、優(yōu)勢。MDA-MB-453，SK-BR3細(xì)胞生長曲線的結(jié)果表明，高表達(dá)Eya1組的細(xì)胞增殖明顯高于對照組和Eya1磷酸酶突變體Eya1D327A組。H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入的結(jié)果表明，Eya1組的細(xì)胞增殖能力大約是對照組的2倍。其次，在細(xì)胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474中檢測高表達(dá)Eya1對細(xì)胞克隆形成的影響。結(jié)果表明高表達(dá)Eya1組細(xì)胞克隆的數(shù)量大約是對照組的1.5-3倍。最后，在MDA-MB-231細(xì)胞

5、中低表達(dá)Eya1，通過以上方法檢測其對細(xì)胞的影響。MTT和細(xì)胞生長曲線結(jié)果均表明，低表達(dá)Eya1的細(xì)胞增殖能力與對照相比大約下降50％；H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入的結(jié)果表明，低表達(dá)Eya1組的細(xì)胞增殖能力大約降低50％。
　　 結(jié)論:蛋白Eya1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　 第二部分
　　 目的:探討蛋白Eya1 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　 方法:在MDA-MB-453細(xì)胞中高表達(dá)蛋白Eya

6、1，然后通過基因芯片技術(shù)篩選出表達(dá)水平變化的基因；經(jīng)分析得到初步的結(jié)果后，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453，SK-BR3，BT474以及MDA-MB-231中，從mRNA 水平和蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果；然后找出Eya1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的下游基因，通過啟動子活性的檢測，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)等實(shí)驗(yàn)確認(rèn)Eya1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的基因；最后，通過細(xì)胞增殖相關(guān)實(shí)驗(yàn)如MTT，細(xì)胞生長曲線及克隆形成等，證實(shí)Eya1 依賴其轉(zhuǎn)錄的下游基因促進(jìn)乳腺

7、癌細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)果：基因芯片提示，MDA-MB-453 高表達(dá)蛋白Eya1后，與細(xì)胞周期密切相關(guān)的基因Cyclin D1 明顯增加；在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453和SK-BR3中，高表達(dá)Eya1 促進(jìn)Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平增加，而在MDA-MB-231細(xì)胞中抑制蛋白Eya1的表達(dá)后Cyclin D1的mRNA表達(dá)水平相應(yīng)下降；還驗(yàn)證了Eya1和Cyclin D1 之間在蛋白水平表達(dá)的一致性；然后，通過對

8、Cyclin D1 啟動子活性的分析表明Eya1 增強(qiáng)Cyclin D1的啟動子活性；染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Eya1 結(jié)合于Cyclin D1的啟動子；在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453和SK-BR3 高表達(dá)蛋白Eya1 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，但是抑制細(xì)胞內(nèi)源性的Cyclin D1表達(dá)能完全抵消蛋白Eya1 對細(xì)胞增殖的作用；還發(fā)現(xiàn)蛋白Eya1促進(jìn)蛋白Six1的表達(dá)，通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者具有相互作用。內(nèi)源性Six1的降低后