IBP調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT及促進(jìn)其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因，腫瘤細(xì)胞的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力與患者預(yù)后密切相關(guān)，然而目前惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍然未明。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)是上皮性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，阻止或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化對控制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，但是目前EMT的發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制還不明確。干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白(Interfe

2、ronregulatoryfactor-4bindingprotein，IBP)是能夠激活RhoGTPase家族中Rac1、RhoA和Cdc42的GEF(鳥苷酸交換因子)分子。研究發(fā)現(xiàn)IBP在免疫系統(tǒng)中具有重要的功能，IBP對免疫穩(wěn)態(tài)的維持不可或缺，IBP敲除小鼠出現(xiàn)血清IgG水平升高、自身抗體產(chǎn)生、效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞積聚等系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣自身免疫性疾病的癥狀;IBP參與免疫突觸形成、T淋巴細(xì)胞激活及Th1/Th2細(xì)胞極化的調(diào)控;I

3、BP與激活的Rac1協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)，同整合素共同影響細(xì)胞的分化;近期研究還發(fā)現(xiàn)IBP參與翻譯后修飾的調(diào)控。目前對IBP的研究主要集中于免疫系統(tǒng)，我們首次報道了IBP與乳腺腫瘤細(xì)胞惡性行為密切相關(guān)，那么IBP是否參與了腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟EMT的調(diào)控，本研究擬對乳腺癌臨床標(biāo)本中的IBP表達(dá)模式做進(jìn)一步的分析，通過一系列體內(nèi)體外實驗研究IBP調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制，為闡明IBP在乳腺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　主要研究內(nèi)容

4、和結(jié)果
　　1.乳腺癌組織芯片和乳腺癌細(xì)胞株分析
　　1)將109例乳腺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織做IBP免疫組化染色，并根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行計分評價，通過對原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶中IBP表達(dá)強(qiáng)度明顯高于原發(fā)灶(p＜0.001)。
　　2)將20例有預(yù)后資料的乳腺癌患者腫瘤組織做IBP免疫組織化學(xué)染色，并根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行計分評價，通過對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果和患者預(yù)后資料進(jìn)行K

5、aplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)IBP表達(dá)強(qiáng)度與乳腺癌患者生存率相關(guān)，IBP表達(dá)水平高的患者生存率低于IBP表達(dá)低的患者(p=0.041)。
　　3)選取9株人乳腺癌細(xì)胞和正常人乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞中IBP表達(dá)水平高;在轉(zhuǎn)移性相對低的乳腺癌細(xì)胞中IBP表達(dá)水平低，正常人乳腺上皮細(xì)胞中未檢測到IBP的表達(dá)。
　　2.IBP調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT及其分子機(jī)制
　　1)通過免疫印跡和細(xì)胞

6、免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)IBP調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT分子標(biāo)志(E-cadherin，Keratin18，F(xiàn)ibronectin，N-cadherin，Vimentin)的表達(dá)水平。
　　2)通過相差顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)IBP改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的EMT表型。
　　3)EGF刺激引起乳腺癌細(xì)胞中Fibronectin的表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，同時，IBP在EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT過程中表達(dá)水平顯著升高。
　　4)EGF活化乳腺

7、癌細(xì)胞中EGFR信號通路，通過免疫印跡對EGFR酪氨酸磷酸化位點1068、1173，ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):IBP影響EGF誘導(dǎo)的EGFR及其下游信號分子的活化。
　　5)利用Real-timePCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中IBP抑制后EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、ZEB1和ZEB2的表達(dá)水平會不同程度降低。
　　6)通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)IBP促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲;利用免疫印

8、跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)IBP促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中金屬蛋白酶的表達(dá)。
　　7)利用免疫熒光技術(shù)我們觀察了IBP對細(xì)胞骨架蛋白微管和微絲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):IBP調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排，IBP促進(jìn)偽足的形成，IBP抑制會引起乳腺癌細(xì)胞骨架排列紊亂。
　　8)利用G-ELISA技術(shù)分析IBP對Rac1，RhoA和Cdc42活性水平的影響:乳腺癌細(xì)胞中IBP通過其GEF活性調(diào)控Rac1，RhoA和Cdc42的活化。
　　3.IBP影響乳腺癌細(xì)胞成瘤和

9、轉(zhuǎn)移能力
　　1)利用裸鼠皮下成瘤動物模型觀察IBP對乳腺癌細(xì)胞成瘤能力的影響，發(fā)現(xiàn)抑制IBP能夠降低乳腺癌細(xì)胞的皮下成瘤能力。
　　2)利用裸鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞動物模型觀察IBP對乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，發(fā)現(xiàn)抑制IBP能夠降低乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。
　　綜上所述，本研究證實IBP與乳腺腫瘤細(xì)胞的惡性行為密切相關(guān)，IBP高水平表達(dá)提示患者預(yù)后不良;利用一系列體內(nèi)外實驗證明IBP通過活化Rac1，RhoA和C