TUFT1在乳腺癌中促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和生存機(jī)制的研究.pdf

1、目的:乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。全世界每年大約有120萬(wàn)的女性患有乳腺癌，50萬(wàn)女性因此病死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，北美和歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，美國(guó)婦女9個(gè)人中將有1人在一生中患乳腺癌。雖然亞洲是乳腺癌的低發(fā)區(qū)，但乳腺癌的發(fā)病率是逐年增高，隨著健康體檢和自身檢查意識(shí)增強(qiáng)，乳腺癌有年輕化趨勢(shì)。乳腺癌是一種復(fù)雜的全身性疾病，多種因素參與到乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展中。乳腺細(xì)胞的癌變、進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程有多種信號(hào)傳導(dǎo)通路參與其中，包括研究較多的

2、雌激素受體(ER)傳導(dǎo)通路，人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)信號(hào)傳導(dǎo)通路等，通過(guò)研究這些信號(hào)傳導(dǎo)通路，人們發(fā)現(xiàn)了多種抗腫瘤的藥物來(lái)拮抗這些信號(hào)通路中某個(gè)節(jié)點(diǎn)來(lái)治療乳腺癌，比如內(nèi)分泌藥物和赫賽汀等靶向藥物。因此影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路中的細(xì)胞因子是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。
　　Tuftelin1(TUFT1)是一種酸性蛋白，最初在牙釉質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，其參與脊椎動(dòng)物牙釉質(zhì)的礦化過(guò)程。TUFT1在桑椹胚、胚胎干細(xì)胞、軟組織（大腦，尤其是神經(jīng)元

3、）、腎臟、腎上腺、肝、睪丸和腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，可能與這些組織、器官的生物學(xué)功能相關(guān)。據(jù)報(bào)道，TUFT1可能參與間充質(zhì)干細(xì)胞的某些功能，并參與神經(jīng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的分化。此外，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，用在1％O2的條件下培養(yǎng)人類肝癌HepG2和乳腺癌MCF-7細(xì)胞可以誘導(dǎo)TUFT1的表達(dá)，而低氧環(huán)境對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)是必要的，從而間接表明TUFT1可能對(duì)這兩種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。這些研究的結(jié)果表明，TUFT1在不同的組織中可能具有多種功能，

4、這些正常功能的改變可以促進(jìn)某些疾病和腫瘤的發(fā)生。然而，TUFT1在乳腺癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
　　我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析乳腺癌中具有大樣本臨床相關(guān)性的表達(dá)差異基因，發(fā)現(xiàn)TUFT1在乳腺癌組織中表達(dá)量較癌旁組織顯著上升;并且通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)MCF-7、T-47D和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中都表達(dá)TUFT1。因此本研究擬以乳腺癌為研究對(duì)象，研究分析TUFT1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，與患者預(yù)后的關(guān)

5、系，對(duì)乳腺癌細(xì)胞株生長(zhǎng)、增殖、凋亡的影響并分析下游可能的信號(hào)傳導(dǎo)通路。旨在初步揭示TUFT1在乳腺癌中的作用機(jī)制，為今后乳腺癌的治療提供新思路。
　　研究方法:
　　一、TUFT1在乳腺癌患者標(biāo)本中的表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TUFT1在乳腺癌中的表達(dá)情況
　　2、分析TUFT1與乳腺癌患者腫瘤大小、組織分級(jí)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間的關(guān)系
　　3、分析TUFT1與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

6、　　二、TUFT1在乳腺癌細(xì)胞株中功能性促癌作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、TUFT1-siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、病毒載體的構(gòu)建及慢病毒的包裝
　　2、慢病毒感染乳腺癌T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞株
　　3、qPCR和蛋白免疫印跡分別檢測(cè)mRNA水平及蛋白水平TUFT1的敲減效率
　　4、Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)
　　5、MTT檢測(cè)細(xì)胞增值
　　6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡
　　二、

7、TUFT1在乳腺癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、PathArray下游基因篩選
　　2、相關(guān)信號(hào)通路中與TUFT1表達(dá)相關(guān)基因的蛋白驗(yàn)證
　　結(jié)果:
　　一、TUFT1在乳腺癌患者標(biāo)本中的表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)TUFT1在乳腺癌中高表達(dá)
　　2、TUFT1高表達(dá)與乳腺癌患者腫瘤大小、組織分級(jí)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)
　　3、TUFT1高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后呈

8、負(fù)相關(guān)
　　二、TUFT1在乳腺癌細(xì)胞株中功能性促癌作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、慢病毒感染乳腺癌T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞后，TUFT1基因和蛋白水平的表達(dá)量降低
　　2、TUFT1表達(dá)下調(diào)可以降低乳腺癌T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖
　　3、TUFT1表達(dá)下調(diào)影響乳腺癌T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞周期的變化
　　4、TUFT1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)乳腺癌T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞

9、凋亡
　　三、TUFT1在乳腺癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、PathArray下游基因篩選出與TUFT1相關(guān)的1095個(gè)差異顯著的基因
　　2、通過(guò)蛋白驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)TUFT1下調(diào)可以引起RelA，Caspase3，DUSP1，RAC1和ZAK的蛋白表達(dá)變化
　　結(jié)論:
　　1、TUFT1在乳腺癌中高表達(dá)并影響乳腺癌患者預(yù)后
　　2、抑制TUFT1表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期并誘導(dǎo)