丙型肝炎病毒核酸國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究.pdf

1、背景和目的 丙型肝炎病毒核酸(HCVRNA)檢測缺乏統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)，給臨床的診斷和治療帶來了很多問題。研制國內(nèi)用于HCVRNA擴(kuò)增檢測的血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，推進(jìn)核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性。替代凍干血清的標(biāo)準(zhǔn)品，使其具有更好的臨床適用性。 方法 1、選擇HCV陽性血漿，用

2、熒光定量PCR檢測試劑進(jìn)行初步檢測，再用陰性的獻(xiàn)血員血漿，除纖維蛋白原(纖原)后進(jìn)行稀釋。采用國際公認(rèn)的PCR內(nèi)標(biāo)定量方法，即ROCHE公司COBASAMPLICOR及相應(yīng)試劑進(jìn)行檢測，以WHO標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC編號(hào)96/790)進(jìn)行比對定值。 2、將該定值制備物發(fā)放給HCVRNA熒光定量試劑的生產(chǎn)廠家進(jìn)行檢測。 3、由于HCV分型和HCVRNA定量檢測試劑盒，所檢測的區(qū)域主要集中在5'-UTR區(qū)，因此本研究擬選用5'-

3、UTR區(qū)作為MS2噬菌體的包裝序列。引物5'端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行T載體克隆后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切獲得所需要的目的片段，與用HindⅢ酶切的表達(dá)載體pNCCL1相連接，構(gòu)建一新的表達(dá)載體pNCCL1-HCV。在IPTG誘導(dǎo)下，衣殼蛋白會(huì)在攜帶有pET-MS2-HCV的細(xì)菌中表達(dá)，并與reRNA組裝成病毒樣顆粒。誘導(dǎo)后的細(xì)菌經(jīng)超聲碎菌，離心后即可得到含病毒樣顆粒的上清。為驗(yàn)證包裝的核酸為HCVreRNA，取20μ

4、l上清按1∶10至1∶106比例稀釋后，依照異硫氰酸胍鹽提取RNA的方法提取VLPs的RNA，然后進(jìn)行RT-PCR。取20μl所得到的上清，加入RNaseA(100U)和DNaseI(20U)，37℃,溫育4天以觀察病毒樣顆粒的穩(wěn)定性。將病毒樣顆粒用PEG6000沉淀后，加入正常人陰性血清，取20μl于45℃放置3天觀察病毒樣顆粒是否適合運(yùn)輸。 結(jié)論 第一部分:研究獲得的定值凍干血清是我國第一個(gè)用于核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。由于該

5、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基質(zhì)為凍干血清，含有完整的病毒核酸序列，與臨床檢測的病人標(biāo)本一致，具有很好的臨床適用性。推廣范圍包括各個(gè)HCVRNA檢測試劑生產(chǎn)廠家、醫(yī)院臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室及進(jìn)行核酸篩查的血站等。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在國內(nèi)主要PCR檢測試劑的生產(chǎn)廠家均得到了應(yīng)用，在穩(wěn)定性及定值的準(zhǔn)確性方面得到了充分肯定。由該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)傳遞的血清基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于血清基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線同待測樣本一樣經(jīng)過純化和逆轉(zhuǎn)錄步驟，消除了標(biāo)準(zhǔn)品與樣本間提取效率和逆轉(zhuǎn)錄效率檢測差異，

6、同時(shí)消除了不同試劑不同人員操作間的差異，又具有溯源性，使檢測結(jié)果準(zhǔn)確并具有可比性，因此該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在臨床基因擴(kuò)增定量檢測HCVRNA方面有廣闊的應(yīng)用前景，將有力的促進(jìn)臨床HBVDNA和HCVRNA定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。 第二部分:研究得到的表達(dá)載體pET-MS2-HCV及原核表達(dá)系統(tǒng)，可以作為構(gòu)建和制備耐RNase的HCVRNA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的平臺(tái)。獲得了HCV1b、2a、6a型三種基因型病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒可以直接作為作為凍干血