麋鹿皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)與細胞周期同步化研究.pdf

1、本文以麋鹿的耳尖皮膚組織為材料進行皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)，對皮膚成纖維細胞進行傳代、冷凍保存、解凍復蘇和部分生物學特性的鑒定；用不同匯合程度、血清饑餓不同時間以及含羞草酸不同劑量和時間對糜鹿皮膚成纖維細胞進行同步化處理后，用流式細胞儀分析細胞周期同步化的效果，豐富麋鹿研究的內容。為組織工程研究提供借鑒資料，為麋鹿的基礎研究和保護瀕危珍稀動物資源提供基礎資料。研究結果如下： 1 麋鹿耳皮膚成纖維細胞的分離與體外培養(yǎng) 本試驗采用組織塊

2、法進行原代培養(yǎng)，獲得麋鹿成纖維細胞，并經(jīng)過反復傳代得以純化。對細胞進行常規(guī)冷凍保存，得到麋鹿皮膚成纖維細胞系．F4代生長曲線中，第5 d群體倍增值為5.50，群體倍增時間為39.03 h，第6 d細胞生長減慢；由分裂曲線看出，分裂指數(shù)最高時期是在培養(yǎng)的第5 d，第6 d急劇下降,細胞生長曲線與分裂指數(shù)表明，麋鹿皮膚成纖維細胞在體外培養(yǎng)條件下存在早期生長延緩和晚期生長抑制，屬于正常的體細胞。麋鹿染色體教目為2n=68，核型式為2(M)＋6

3、4(A)，XY(A，M)。血清濃度對細胞的生長有影響，10％和15％NCS組有明顯的對數(shù)生長期，但在對數(shù)生長期末凋亡和死亡的細胞數(shù)較多，20％NCS組沒有明顯的對數(shù)生長期，并且細胞數(shù)目少于10％和15％NCS組，因此細胞培養(yǎng)過程中采用10％NCS，每3 d換一次液，在發(fā)生密度抑制和接觸抑制前就進行傳代，避免營養(yǎng)枯竭和代謝物積累。細胞冷凍時采用10％DMSO作冷凍保護劑，冷凍時先在4℃放置30 min，移入-20℃放置1.5 h，再在液氮

4、面上方懸吊7～8 h后投入液氮，復蘇后可獲得87.78％的貼壁率。 2 麋鹿皮膚成纖維細胞的細胞周期同步化研究：為了了解麋鹿細胞周期調控的特點，本試驗對麋鹿皮膚成纖維細胞進行不同匯合程度、血清饑餓不同時間以及含羞草酸(mimosine)不同劑量和時間的處理，利用流式細胞儀分析細胞周期。結果表明，100％匯合1d的細胞GO/Gl期比例可達91.95％，但是匯合2d后繼續(xù)培養(yǎng)會導致DNA片段化和細胞的異常聚集。血清饑餓能夠迅速地改變麋鹿皮膚

5、成纖維細胞的細胞周期狀態(tài)，使GO/G1期細胞比例升高，G2/M期細胞比例降低，血清饑餓處理24h后有89.42％的細胞處于GO/GL期,當處理時間超過144h后細胞凋亡和異常聚集的比例會增加。適宜劑量的含羞草酸能夠使麋鹿成纖維細胞達到同步化的目的，但效果低于接觸抑制和血清饑餓,并且也會對細胞造成損傷。 本研究的創(chuàng)新之處在于豐富了麋鹿研究的基礎資料。麋鹿有“活化石”之稱，但目前對麋鹿的基礎研究在許多方面仍是空白，本試驗建立麇鹿皮膚