多次食管酸灌注對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥表型及TRPA1受體的影響.pdf

1、[目的]：
　　1.制作胃食管反流（Gastroesophageal reflux，GER）及哮喘小鼠模型;
　　2.觀察胃食管反流小鼠、哮喘小鼠、胃食管反流合并哮喘小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子蛋白濃度水平及肺組織中瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白A1(Transient receptorpotential A1，TRPA1)的分布及表達(dá)量;
　　3.研究胃食管反流相關(guān)哮喘小鼠的氣道炎癥表型及TRPA1在其中的作用。
　　[方法]：

2、
　　將60只8～9周齡、體重相似的清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分成6小組，分別為正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組，每組10只小鼠。通過腹腔注射和霧化吸入雞卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)建立哮喘小鼠模型;通過食管下段灌注人工胃液建立胃食管反流小鼠模型，灌鹽組即用生理鹽水代替人工胃液。完成整個(gè)造模過程后24小時(shí)處死小鼠。收集小鼠血清、肺泡灌洗液、食管中下段組織、肺組織;肺泡灌洗液(Bronchoal

3、veolar lavage fluid, BALF)細(xì)胞沉淀做細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)，上清液用BCA蛋白檢測(cè)方法檢測(cè)蛋白濃度和用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)蛋白濃度;血清用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)IL-5、IL-8蛋白濃度;食管組織和肺組織用于做石蠟切片，經(jīng)HE染色后觀察組織形態(tài)學(xué)改變情況;肺組織石蠟切片用免疫組化方法檢測(cè)TRPA1的分布和表達(dá)情況

4、。
　　[結(jié)果]：
　　1.食管組織HE染色
　　胃食管反流小鼠，包括灌酸組、哮喘灌酸組小鼠的食管組織發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，粘膜上皮局部增生，固有層有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體肥大，但未見明顯潰瘍形成。非胃食管反流小鼠，包括正常組、灌鹽組、哮喘組、哮喘灌鹽組小鼠的食管組織層次結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)的改變。
　　2.肺組織HE染色
　　哮喘小鼠，包括哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠的氣道和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，可見異常

5、分泌物，氣道上皮組織破壞、脫落，粘膜充血、水腫，管腔變狹窄，腺體肥大，氣道和血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)，其中哮喘組與哮喘灌鹽組小鼠以嗜酸性粒細(xì)胞滲出浸潤(rùn)為主;哮喘灌酸組小鼠以中性粒細(xì)胞滲出浸潤(rùn)為主，而且炎癥表現(xiàn)最為嚴(yán)重。胃食管反流小鼠，包括灌酸組及哮喘灌酸組小鼠的肺組織可見炎癥細(xì)胞滲出浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞滲出浸潤(rùn)為主。正常組小鼠肺組織層次結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯形態(tài)學(xué)的改變。灌鹽組小鼠肺組織可見輕度炎癥。
　　3.BALF中細(xì)胞總

6、數(shù)及分類計(jì)數(shù)
　　哮喘小鼠包括哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)較正常組升高，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例較正常組均升高。灌酸組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞較正常組、灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01);哮喘組、哮喘灌鹽組小鼠BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞比例較正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘灌酸組均升高明顯(P＜0.05或P＜0.01);哮喘灌酸組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例較正常組、灌鹽組、

7、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.BALF中總蛋白濃度
　　哮喘小鼠包括哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠BALF中的總蛋白濃度較正常組明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，其中以哮喘灌酸組小鼠升高最為明顯，較灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。哮喘組、哮喘灌鹽組小鼠分別較灌鹽組、灌酸組均升高(P＜0.05)。
　　5.小鼠體內(nèi)IL-5、IL

8、-8蛋白濃度變化
　　BALF、血清中的IL-5:哮喘小鼠BALF及血清中的IL-5蛋白濃度明顯升高，哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠分別較正常組、灌鹽組、灌酸組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　BALF、血清中的IL-8: BALF中IL-8，哮喘組與哮喘灌鹽組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組均升高，哮喘灌酸組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01);血清中IL-8，灌酸

9、組小鼠較正常組、灌鹽組均升高，哮喘組與哮喘灌鹽組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組均升高，哮喘灌酸組小鼠較正常組、灌鹽組、灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組均升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　6.免疫組化標(biāo)記小鼠肺組織TRPA1的分布及表達(dá);
　　TPRA1在小鼠的氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見表達(dá)，顯微鏡下呈現(xiàn)黃色或棕黃色;其中灌酸組、哮喘組、哮喘灌鹽組、哮喘灌酸組小鼠較正常組、灌鹽組的表達(dá)量明顯

10、升高，以哮喘灌酸組小鼠升高尤為突出(P＜0.05或P＜0.01)。
　　[結(jié)論]：
　　1.依據(jù)食管和肺組織病理結(jié)果，說明建立胃食管反流及哮喘小鼠模型成功;
　　2.本實(shí)驗(yàn)通過建立胃食管反流并哮喘小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)胃食管反流相關(guān)哮喘是以中性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥表型，與過敏性哮喘不同;胃食管灌注人工胃液可引起肺部炎癥加重，哮喘病理改變加重;
　　3.推測(cè)GER導(dǎo)致正?；蛳∈髿獾姥装Y可能與肺組織上的TRPA1受體