人羊膜間充質(zhì)干細胞靜脈移植對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響.pdf

1、第一部分哮喘小鼠動物模型的制備
　　目的：雞卵清白蛋白(OVA)腹腔聯(lián)合皮下注射致敏和霧化激發(fā)小鼠，制備哮喘模型。
　　方法：將BALB/c雌性小鼠隨機分為哮喘組(AS)和生理鹽水對照組(NS)，每組7只。兩組小鼠于第1、13天分別以O(shè)VA和生理鹽水腹腔聯(lián)合皮下注射致敏，第19d分別予10％OVA溶液、生理鹽水連續(xù)霧化激發(fā)5d，末次激發(fā)24h后處死小鼠。測定小鼠BALF細胞總數(shù)和細胞分類計數(shù)，采用ELISA檢測BALF的IL

2、-5、IL-12、IL-17水平，HE染色觀察肺組織病理學改變，AB-PAS染色觀察氣道上皮杯狀細胞和黏液物質(zhì)改變，VG染色觀察氣道周圍膠原纖維沉積，免疫組化染色和實時定量PCR檢測肺組織Muc5ac蛋白和mRNA表達水平。結(jié)果：AS組小鼠BALF細胞總數(shù)、細胞分類計數(shù)、IL-5、IL-17表達水平、氣道炎癥細胞浸潤評分、氣道壁厚度、氣道上皮杯狀細胞及黏液物質(zhì)陽性相對著色面積、氣道周圍膠原纖維陽性相對著色面積、Muc5ac蛋白及mRNA

3、表達均高于NS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。IL-12表達水平低于NS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：以O(shè)VA腹腔聯(lián)合皮下注射致敏和霧化吸入激發(fā)可成功復制小鼠哮喘模型。
　　第二部分人羊膜間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：從人羊膜組織中分離、純化及鑒定間充質(zhì)干細胞。
　　方法：收集健康足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦新鮮胎盤，采用機械聯(lián)合胰蛋白酶-膠原酶消化法分離人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAMSCs)，

4、通過貼壁、酶消化法進行傳代培養(yǎng)，觀察P1~P3代細胞形態(tài)，傳至第三代的hAMSCs，采用流式細胞術(shù)(FCM)鑒定細胞表型特征。
　　結(jié)果：hAMSCs呈典型貼壁生長，纖維狀，長梭形。第3代hAMSCs高表達CD90，CD105， CD44，CD73，幾乎不表達CD34，CD11b，CD19，CD45和HLA-DR。
　　結(jié)論：從體外成功分離培養(yǎng)出人羊膜間充質(zhì)干細胞。
　　第三部分人羊膜間充質(zhì)干細胞靜脈移植對哮喘小鼠氣道

5、的影響
　　目的：觀察人羊膜間充質(zhì)干細胞靜脈移植對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響。
　　方法：將35只雌性BALB/c小鼠按隨機數(shù)字法分為NS組、AS組、人羊膜間充質(zhì)干細胞干預組(AS+hAMSCs)、人羊膜間充質(zhì)干細胞自身對照組(NS+hAMSCs)、地塞米松干預組(AS+DEX)，每組7只。AS組和NS組處理同第一部分。AS+hAMSCs組在第1次致敏后第18d通過尾靜脈注射Brdu標記的第3代hAMSCs懸液（1×1

6、06）0.25ml/只，余處理同AS組；NS+hAMSCs組第18d經(jīng)尾靜脈注射Brdu標記的第3代hAMSCs懸液（1×106）0.25ml/只，余處理同NS組；AS+DEX組于每日霧化激發(fā)前30min，予地塞米松2mg/kg腹腔注射，余處理同AS組；檢測各組小鼠BALF細胞總數(shù)和細胞分類計數(shù)，ELISA測定IL-5、IL-12、IL-17水平變化，免疫熒光染色觀察hAMSCs經(jīng)Brdu標記率及hAMSCs在體內(nèi)定植情況；HE， AB

7、-PAS，VG，免疫組化染色和實時定量PCR檢測指標同第一部分。
　　結(jié)果：免疫熒光染色在兩組小鼠體內(nèi)均可檢測到hAMSCs的定植，以AS+hAMSCs組肺組織細胞定植明顯。AS+hAMSCs組 BALF細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞百分比、IL-5、IL-17水平、氣道周圍炎癥細胞浸潤評分、氣道壁厚度、氣道周圍膠原纖維沉積面積、氣道上皮杯狀細胞和黏液物質(zhì)陽性相對著色面積、肺組織Muc5ac蛋白及Muc5ac mRNA表達水平均較AS組降

8、低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；較NS組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。IL-12表達水平較AS組升高，較NS組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NS+hAMSCs組與NS組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：1. hAMSCs靜脈移植能歸巢至小鼠肺組織，以哮喘組明顯。2. hAMSCs干預可減輕哮喘氣道炎癥及氣道重塑，其機制可能是通過抑制IL-5、IL-17的表達促進IL-12表達而調(diào)節(jié)