CKLF1-C19多肽對博萊霉素誘導小鼠肺纖維化病變的干預作用.pdf

1、研究背景：
　　Chemokine-like factor1（CKLF1）是北京大學人類疾病基因研究中心首次在國際上克隆的一個新細胞因子，獲國內和國際專利1。CKLF1含有CC家族趨化因子的特征性結構，有研究表明CKLF1對白細胞趨化作用，可促進小鼠骨骼肌的增殖，并可促進人低密度骨髓增殖及集落形成等1。研究證實 CKLF1的功能性受體是CCR42。緊隨 CKLF1的源頭創(chuàng)新工作，本課題組曾首次在國際上報道了CKLF1在哮喘患者的外

2、周血單個核細胞及氣道粘膜中高表達3；首次報道了CKLF1可在小鼠體內誘導支氣管肺的炎性損傷及重塑作用4,5。因此干預CKLF1介導的炎癥趨化作用，尋找新的相關治療靶點無疑具有重要的臨床意義。
　　進一步的研究表明重組CKLF1在果蠅 S2細胞中可分泌一個位于C末端的19個氨基酸肽段，被命名為CKLF1-C19多肽，簡稱C196。實驗表明C19可抑制由CKLF1導致的趨化作用，在小鼠支氣管哮喘、過敏性鼻炎等疾病中發(fā)揮著干預治療作用，

3、可能是CKLF1的有效拮抗劑7,8。因此，我們推測C19亦可在肺纖維化病變中發(fā)揮干預炎癥的作用。為此我們將 C19合成肽引入到肺纖維化研究中。研究分為三個部分：第一部分探討無創(chuàng)肺功能監(jiān)測在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的應用價值；第二部分探討 C19在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的干預保護作用；第三部分探討 C19在不同給藥階段對于博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的治療作用。
　　第一部分：探討無創(chuàng)肺功能監(jiān)測在博萊霉素誘導的

4、小鼠肺纖維化模型中的應用價值目的：
　　制備肺纖維化模型，探討無創(chuàng)肺功能監(jiān)測在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的應用價值。
　　方法：
　　20只C57 BL/6雌性小鼠隨機分為NS組和模型組，模型組小鼠氣管滴入0.1ml博萊霉素溶液（5mg/kg），而NS組小鼠則給0.1ml生理鹽水。在造模前、造模7、14、21天分別監(jiān)測每一只小鼠的無創(chuàng)肺功能指標Penh值(增強呼吸間隙)及各自體重，并在造模21天后留取小鼠的肺組織

5、做常規(guī)H&E染色。
　　結果：
　　造模前小鼠體重及Penh值兩組均無顯著差異（P>0.05）。模型組小鼠體重在造模7、14、21天顯著低于NS組（P<0.05）；而模型組Penh值在造模7、14、21天卻顯著高于NS組（P<0.05）。在肺組織HE染色中可見模型組小鼠肺組織結構破壞、炎癥細胞浸潤及局部纖維增生，且小鼠肺纖維化程度（Ashcroft評分）與Penh值呈高度正相關（r=0.869，P＜0.001）。
　　

6、結論：
　　Penh值與博萊霉素誘導小鼠肺纖維化模型中的膠原纖維沉積和肺組織病理改變成高度正相關，可有效反映肺纖維化病理改變，并作為氣流受阻及肺阻力的動態(tài)指標。
　　第二部分：探討C19在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的干預保護作用目的：
　　探討C19在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的干預保護作用。
　　方法：
　　50只C57 BL/6雌性小鼠隨機分為NS組、模型組及藥物低中高劑量組。模型組和藥物低

7、中高劑量組小鼠氣管滴入0.1ml博萊霉素溶液（5mg/kg），而NS組小鼠則給0.1ml生理鹽水。在造模當天即給予藥物組小鼠腹腔注射 C19溶液，并從造模當天直至造模第21天，C19按藥物低中高劑量組的不同分別給予每只小鼠每天1ug、10ug、100ug；而模型組和NS組小鼠則給予同等體積的生理鹽水腹腔注射。記錄小鼠每天生存狀態(tài)及體重，在造模第21天留取小鼠肺泡灌洗液（BALF），并留取左肺的肺組織行H&E染色，觀察其病理形態(tài)改變；留取

8、小鼠右肺的肺組織行羥脯氨酸（HYP）含量測定。
　　結果：
　　在小鼠一般生存狀態(tài)觀察、體重分析中藥物低中高劑量組優(yōu)于模型組；在肺泡灌洗液中的細胞計數、肺組織羥脯氨酸含量統(tǒng)計中，藥物低中高劑量組小鼠均顯著低于模型組小鼠；在病理學形態(tài)觀察中，藥物低中劑量組與模型組相比較，可顯著減輕炎癥細胞的浸潤及間質纖維細胞的增生，較好的恢復了小鼠正常的肺組織結構。
　　結論：
　　C19可降低博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠的死亡率、

9、減輕肺部炎癥細胞的浸潤和間質纖維細胞的增生、及顯著降低肺組織羥脯氨酸的含量。其中 C19低劑量組與其他藥物組相比，更能顯著減輕肺部炎癥細胞的浸潤和間質纖維細胞的增生第三部分：探討C19在不同給藥階段對博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型的治療作用。
　　目的：
　　探討 C19在不同給藥階段對于博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的治療作用。
　　方法：
　　80只C57 BL/6雌性小鼠隨機分為8組：○1 NS組，每天每

10、只小鼠給予腹腔注射0.2ml生理鹽水；○2模型組，每天每只小鼠給予腹腔注射0.2ml生理鹽水；○3 C19-1ug1-21天組（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，從造模當天至造模第21天）；○4 C19-1ug1-10天組（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，從造模當天至造模第10天）；○5 C19-1ug7-21天組（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，從造模第7天至造模第21天）；○6 C19-5ug1-21天組（每只

11、小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，從造模當天至造模第21天）；○7 C19-5ug1-10天組（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，從造模當天至造模第10天）；○8 C19-5ug7-21天組（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，從造模第7天至造模第21天）。記錄小鼠每天生存狀態(tài)，并在實驗前，造模第3、7、11、14、17、21天分別測各組小鼠的無創(chuàng)肺功能指標。在造模第21天深度麻醉所有小鼠后，監(jiān)測小鼠有創(chuàng)肺功能指標，再行腹主

12、動脈放血，用4℃PBS進行肺泡灌洗（每次0.8ml,抽吸3次，總共灌洗3次），留取肺泡灌洗液行細胞計數。并留取小鼠左肺的肺組織行H&E染色，觀察其病理形態(tài)改變；留取小鼠右肺的肺組織行羥脯氨酸含量測定。
　　結果：
　　通過對小鼠生存率、體重、Penh值、氣道內阻力、BALF中的細胞計數、肺組織HYP含量及病理切片H&E染色的方面分析，C19的1ug三個不同組別對于肺纖維化均有明顯的治療作用。而C19的5ug組在造模當天開始給

13、藥的1-21天組和1-10天組在生存率、體重、肺功能、BALF細胞計數、HYP含量、病理等方面有不同程度上可對肺纖維化有保護干預作用，但從造模第7天開始給藥的組別小鼠死亡率顯著高于模型組小鼠，且在HYP含量、病理方面也接近于模型組的結果，其緩解肺纖維化的效果不十分顯著。
　　結論：
　　C19（1ug）可降低博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠的死亡率、減緩造模所致體重下降的趨勢、緩解造模所致的Penh值和氣道內阻力升高的趨勢、降低肺