化纖湯對博萊霉素致大鼠肺纖維化干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肺間質(zhì)纖維化是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為主要特征的疾病。目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，又無確切有效的藥物治療。探討中醫(yī)藥對肺纖維化的防治具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義。本課題采用大鼠一次性氣管內(nèi)滴注博萊霉素法造模，通過觀察大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)變化、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率變化、血清中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平、肺組織中CTGF的表達(dá)、肺組織勻漿中SOD和GSH-PX的活性及MDA的含量，來探討肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)

2、制，并觀察具有“益氣通陽、行氣活血化痰”功效的化纖湯對這些指標(biāo)的影響，以探討化纖湯對大鼠肺纖維化的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為尋求中醫(yī)中藥對肺纖維化的防治進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 方法：健康Wistar大鼠240只，體重180-220克，隨機(jī)分為正常對照組(A組)、模型組(B組)、強(qiáng)的松干預(yù)組(C組)、化纖湯大劑量(D組)、中劑量組(E組)、小劑量(F組)干預(yù)組共6組。A、B、C、D四組每組各48只(其中24口、用于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的提取)，E

3、、F組各24只。采用一次性氣管內(nèi)滴注博萊霉素(5mg/kg·bw)法造模，各組均于造模后第二天開始灌胃給藥。C組每日一次給予醋酸強(qiáng)的松混懸液(0.32mg/ml)灌胃，D、E、F組每日一次給予化纖湯(濃度分別是2g/ml、1g/ml、0.5g/ml)灌胃，A、B組每日給予一次等容積的生理鹽水灌胃，其中強(qiáng)的松和化纖湯用量相當(dāng)于成人常用量，按體表面積折算。分別于第7、14、28天隨機(jī)處死A、B、C、D四組的大鼠各8只，取材用于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)

4、胞的分離和純化；其余各組大鼠亦于第7、14、28天隨機(jī)處死8只，用于形態(tài)學(xué)觀察及血清、組織勻漿的制備。 ①在光鏡及電鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化及超微結(jié)構(gòu)的改變； ②用流式細(xì)胞儀檢測肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率的變化情況。 ③用ELISA 法檢測血清中IL-6、TNF-α表達(dá)水平的變化； ④用免疫組化SABC法檢測肺組織中CTGF的表達(dá)； ⑤分別用 TBA 法和比色法檢測肺組織勻漿中SOD和GSH-P

5、X的活性及MDA的含量。 結(jié)果： ①肺大體形態(tài)改變：各時(shí)間點(diǎn)，A組大鼠雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性好。B組，第7天，雙肺見密集的點(diǎn)狀出血灶樣瘀斑，肺體積增大；第14天，雙肺呈灰白色，局部可見大小不等的結(jié)節(jié)樣改變及陳舊性出血點(diǎn)，肺組織較硬；第28天，雙肺蒼白，體積縮小，觸及較硬，表面結(jié)節(jié)樣改變及條索狀凹溝。與B組比較，第7天時(shí)，C、D、E、F組兩肺外觀病理變化明顯好于B組，兩肺稍暗紅，彈性可，其中D、C、E組明顯好于F組；

6、第14-28天，D、E組大部分動物兩肺顏色稍暗，彈性尚可，偶可見部分肺葉有散在的點(diǎn)狀灰色斑塊，F(xiàn)、C與B組病變相近。 ②形態(tài)學(xué)改變：第7天，B組大鼠肺泡壁增厚，伴有炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增多，病灶內(nèi)肺泡萎縮，肺泡內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤；第14天，肺泡間隔明顯增寬，成纖維化和膠原基質(zhì)明顯增多；第28天，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁顯著增厚，肺間質(zhì)纖維化瘢痕形成，毛細(xì)血管腔閉塞。超微病理示：B組大鼠第7天，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增生、腫脹，線

7、粒體腫脹，嵴縮短、斷裂或消失，甚至空泡樣變性，板層小體數(shù)量增多，但是多呈空泡樣，細(xì)胞微絨毛破壞、稀少或消失；第14-28天，肺泡Ⅱ型細(xì)胞數(shù)量較第7天減少，核形態(tài)不規(guī)則，線粒體嵴斷裂或消失，大多呈空泡樣變性，數(shù)量明顯減少，板層小體量也減少，大多呈空泡樣變。與B組比較，這些病理變化，第7天，D組改善最明顯，其次為C、E、F組；第14天，D組改善最明顯，其次為E、C、F組；第28天，D組改善最明顯，其次為E、F、C組，其中第7天、28天肺泡炎

8、、肺纖維化Szapiel分級比較具有顯著性差異(P<0.01或0.05)。 ③與A組比較，各時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與B組比較，第7天時(shí)，C、D兩組凋亡率均有顯著降低(P<0.05)；第14-28天，C組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率有所下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異(P>0.05)，D組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率有顯著減少(P<0.05)。 ④與A組比較，各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清中TNF-α、IL-6

9、水平明顯增高。與B組比較，第7天，C、D、E、F各組大鼠血清中 TNF-α、IL-6的水平顯著降低(P<0.01或0.05)；第14-28天，D、E組大鼠血清中 TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.01或0.05)，C、F組雖有降低，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 ⑤與A組比較，各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織中 CTGF 的表達(dá)明顯增高(P<0.01)。與B組比較，各時(shí)間點(diǎn)，C、D、E各組CTGF表達(dá)均低于B組(P<0.

10、01或0.05)，F(xiàn)組低于B組，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 ⑥與A組比較，各時(shí)間點(diǎn)，B、C、D、E、F各組大鼠肺組織中GSH-PX、SOD的活性均降低，MDA的含量均增高，存在顯著差異(P<0.01或0.05)。與B組比較，各時(shí)間點(diǎn)，D、E組大鼠GSH-PX與SOD的活性均升高，MDA含量均降低，存在顯著差異(P<0.01或0.05)；第7-14天，C組大鼠GSH-PX與SOD的活性均升高，MDA 含量均降低，存在

11、明顯差異(P<0.05)，第28天，C組與B組無明顯差異(P>0.05)。各時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)組與B組比較無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： ①模型組病理特征變化與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明造模成功；化纖湯對肺纖維化發(fā)展各個(gè)階段的病理變化有明顯的改善作用，且大、中劑量組明顯優(yōu)于小劑量組。 ②ATⅡ細(xì)胞過度凋亡可能促進(jìn)肺泡炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致炎癥后纖維增生；化纖湯對ATⅡ細(xì)胞可能有抗凋亡作用，可能通過抑制ATⅡ細(xì)胞的過度凋亡而起到保護(hù)

12、和修復(fù)肺泡結(jié)構(gòu)及功能的作用，從而減輕BLM對大鼠肺組織的損傷，延緩并減輕肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。 ③化纖湯能降低肺纖維化大鼠血清中 TNF-α、IL-6水平，可能通過下調(diào)上述細(xì)胞因子水平而對博萊霉素致大鼠的肺損傷起保護(hù)作用，減輕肺纖維化形成的程度，化纖湯大、中劑量組療效優(yōu)于小劑量組。 ④CTGF可能在肺泡炎、肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，其表達(dá)程度與肺纖維化的程度密切相關(guān)；化纖湯可能通過抑制CTGF的表達(dá)對肺組織起