小鼠骨髓間質干細胞的分離及其誘導定向脂肪細胞分化.pdf

1、骨髓間充質干細胞(MSCs)是一種具有高度增殖和分化潛能的干細胞，也是較原始的細胞，常維持在低分化狀態(tài)。它的多向分化潛能在神經、血液、心肌梗死和腫瘤的治療多方面取得成效，廣泛應用于自體和異體移植。并且易于轉導而成為基因治療的靶向物，從分子水平成為很多疑難雜癥的治療新途徑。就整形燒傷及組織工程學方面，定向分化為脂肪細胞有其重要作用。 國內外已經用人，兔，豬，鼠，狒狒等物種提取MSCS來分化為脂肪細胞?？刂瞥芍毎虬ˋP<,2

2、>，PPAR<,2>，CEBP<,12>，CEBP/β<'[1]>等轉錄因子。其中BMS既支持脂肪前體的形成，也支持成熟脂肪細胞的形成。而BMP雖然也是調控因子，但在不同的情況下起促進還是抑制作用有一定爭議，BMP-2在成脂分化中是起促進作用，而在原代MSC培養(yǎng)中又起抑制作用。而近幾年來也有新的發(fā)現(xiàn)，降血糖藥<'[2]>例如羅格列酮或者是低氧環(huán)境有極．大的促進成脂作用。 在較早的報道中，地塞米松(DXM)是最主要的誘導劑，它可以

3、促進成脂及成軟骨上調基因的表達，但單用生成比例較低。之后Janderova<'[3]>通過對比篩選法建立MSCs向脂肪細胞分化的較佳方案，合用199培養(yǎng)基，胰島素，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，消炎痛，地塞米松及5﹪的胎牛血清。而Scavoa<'[4]>等指出若加入極微小濃度(納摩爾)的胰島素樣生長因子IGFI即可刺激并且促進生長。以上的研究雖然列出主要誘導劑，但在促進成脂肪細胞的生成百分比不一。另外，MSCs在分化的過程中相似的誘導劑在

4、不同的劑量或處理條件下會使之向骨及軟骨組織和脂肪組織幾個方向分化，只是所占比例不同，脂肪比例少時只有6﹪-10﹪，生成成熟脂肪細胞的條件不穩(wěn)定。那么本文旨在研究最適宜的誘導方案，優(yōu)化誘導條件，通過免疫組化的方法加以鑒定，最大程度的定向成脂。我們觀察到傳代后純化的MSCS成脂后油紅染色呈桔紅色，胞內充滿脂肪滴，倒置顯微鏡下目測十個非重疊視野統(tǒng)計后成熟脂肪細胞比例達90﹪以上。檢測堿性磷酸酶染色陽性，MAC-1和Ⅷ因子染色陰性，排除巨噬細胞

5、，中性粒細胞和造血細胞的可能。本實驗為組織工程和進一步研究在生理病理狀態(tài)下MSCS成脂過程奠定基礎。 目的：建立小鼠骨髓間質干細胞(MSCs)的分離和鑒定方法；穩(wěn)定和優(yōu)化骨髓間充質干細胞在體外定向向脂肪細胞分化的適宜誘導條件；初步探索其向脂肪細胞組織工程的可行性，為解決臨床軟組織缺損的損傷修復和整形難題提供理論和實踐基礎。 方法：采取貼壁細胞分離法，分離和純化小鼠骨髓MSCs；選用第5代小鼠骨髓MSCs，分別采用CFU-

6、f培養(yǎng)法和CFU-f集落再克隆生成CFU-f集落法鑒定骨髓MSCs的增殖和自我更新能力；利用不同組合的成脂培養(yǎng)基定向誘導骨髓MSCs分化為脂肪細胞；利用油紅0免疫組化染色鑒定分化后的細胞。 結果：分離和純化的小鼠骨髓MSCs呈均勻有序的成纖維母細胞樣形態(tài)；植入2000個～100000個細胞/皿時，可生成不同比例的純的CFU-f集落，所生成純的CFU-f集落數(shù)與種入的細胞數(shù)呈良好的線性關系；小型CFU-f集落再克隆生成CFU-f集

7、落的能力較弱；而大型CFU-f集落具有較高的再克隆生成CFU-f集落的能力，再克隆生成CFU-f集落率高達90﹪，而且往往一個目的集落可再克隆生成多個CFU-f集落；不同誘導方案均可誘導MSC生成脂肪細胞，而合用地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素和消炎痛時效果最佳，誘導MSC生成脂肪細胞的效率可高達96﹪以上。絕大多數(shù)為油紅0染色陽性的成熟脂肪細胞。 結論：實驗結果表明我們采取貼壁細胞分離法，經過長期傳代可得到純化的小