兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及向成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 軟骨組織損傷是近年來常見的疾病，創(chuàng)傷及非創(chuàng)傷性的病理損傷為其常見病因，由于軟骨結(jié)構(gòu)由Ⅱ型膠原相互交織形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及包埋其中的蛋白多糖及軟骨細(xì)胞所構(gòu)成，而且軟骨組織內(nèi)沒有血管及軟骨細(xì)胞的增生及遷移能力有限，因此軟骨損傷后的軟骨自身修復(fù)能力差。目前臨床上沒有較好的方法來治療軟骨缺損，近年來利用組織工程學(xué)方法治療軟骨缺損成為研究的熱點(diǎn)之一。而組織工程學(xué)所應(yīng)用的種子細(xì)胞主要包括成體干細(xì)胞及自體軟骨細(xì)胞。自體軟骨細(xì)胞由于

2、存在細(xì)胞數(shù)目少、移植后遠(yuǎn)期效果不佳以及供區(qū)可發(fā)生并發(fā)癥等問題，而影響了其在臨床的應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bMSCs)是骨髓中除了造血干細(xì)胞之外的另一類成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在不同的條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞，但目前由于沒有特異性的表型，其鑒定尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)鑒定依賴于其形態(tài)水平、功能特征及培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型來協(xié)助鑒

3、定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。由此成功分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化為成軟骨細(xì)胞，對(duì)治療軟骨損傷具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)擴(kuò)增、鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用其分化潛能，觀察其誘導(dǎo)分化為成軟骨細(xì)胞的可行性。
　　 方法：
　　 1.BMSCs的分離純化與培養(yǎng)：取3月齡健康新西蘭大耳白兔6只，行雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)平臺(tái)穿刺抽取骨髓5mL，以1.073g/ml密度Percoll分離液結(jié)合密度梯度離心法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bon

4、e marrow mesenchymal stem cells，bMSCs)，懸浮于含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL)，輕輕吹打均勻，接種到25cm2培養(yǎng)瓶，置37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％C02及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1：2比例傳代培養(yǎng)。
　　 2.BMSCs生長曲線的測(cè)定：取第3代生長良好的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以每孔細(xì)胞濃度為1×108 L-1分別

5、接種于24孔板中的各孔，每孔1mL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％C02及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第2天起每日取3孔，去除培養(yǎng)液，胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 3.BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定：細(xì)胞生長接近融合時(shí)，取第5代生長良好的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液沖洗2遍，并制備成(5~10)×108L L-1濃度的細(xì)胞懸液，取

6、0.1mL細(xì)胞懸液置于不同離心管中，各個(gè)離心管中分別加入CD29、CD44、CD45的一抗，37℃孵箱孵育20min后，以PBS緩沖液沖洗2遍后，加入二抗37℃孵箱孵育20min，沖洗后重懸細(xì)胞于0.5mLPBS緩沖液中為流式細(xì)胞分析用。
　　 4.BMSCs向成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)：取第3代生長良好的兔BMSCs，以1×108 L-1的細(xì)胞濃度接種于內(nèi)含蓋玻片的12孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞完全貼壁，將細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，

7、對(duì)照組繼續(xù)以含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)組換成含成軟骨誘導(dǎo)劑的H-DMEM培養(yǎng)液(含TGF-I10μg/L、IGF-I110μg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、維生素C0.05mmol/L)，每2d或3d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。誘導(dǎo)21d后免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察原代細(xì)胞2d或3d首次換液后

8、，可見少量單個(gè)核細(xì)胞貼壁生長，多為短柱性或多角形。4d或5d全量換液，去除大量漂浮的細(xì)胞，可見分散的BMSCs小集落，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，胞核為圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)可見較多的顆粒。6~9d時(shí)細(xì)胞迅速生長，小集落逐漸融合成大集落，可呈輻射狀生長，10~14d細(xì)胞大部分融合，達(dá)90％以上，細(xì)胞形態(tài)均勻，長梭形，排列緊密，呈旋渦狀或菊花狀。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)更為均一，排列更加整齊，增殖速度明顯加快，6~8d細(xì)胞可融合達(dá)90％以上，可再行傳

9、代。
　　 2.BMSCs生長曲線細(xì)胞生長2d內(nèi)處于潛伏期，生長緩慢，3~5d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，呈對(duì)數(shù)增長，6~8d處于平臺(tái)期，細(xì)胞鋪滿瓶底，增殖緩慢。
　　 3.流式細(xì)胞結(jié)果分析
　　 3.1原代細(xì)胞流式細(xì)胞分析結(jié)果：原代細(xì)胞有62.4％的細(xì)胞表達(dá)CD29，有60.3％的細(xì)胞表達(dá)CD44，有2.79％的細(xì)胞表達(dá)CD45。
　　 3.2傳代細(xì)胞的流式細(xì)胞分析：第3代有99.9％的細(xì)胞表達(dá)CD29，有99.6

10、％的細(xì)胞表達(dá)CD44，有2.62％的細(xì)胞表達(dá)CD45。
　　 4.II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色BMSCs誘導(dǎo)21d后可見Ⅱ型膠原陽性細(xì)胞較多，陽性位置位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色細(xì)密顆粒，在胞核周圍更加明顯。平行培養(yǎng)未誘導(dǎo)的BMSCs棕黃色顆粒不明顯，著色較淺，陽性細(xì)胞數(shù)目較少。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)首次通過流式細(xì)胞術(shù)顯示原代細(xì)胞與第3代細(xì)胞各因子表達(dá)情況不同，原因可能是原代細(xì)胞通過密度梯度離心法分離后，

11、仍有部分其他細(xì)胞伴隨培養(yǎng)，隨著細(xì)胞的擴(kuò)增傳代，雜細(xì)胞逐漸減少，BMSCs的純度越來越高，第3代細(xì)胞高度表達(dá)CD29、CD44而不表達(dá)CD45，表明所培養(yǎng)的BMSCs是單一的細(xì)胞群，不含造血細(xì)胞等其他細(xì)胞，其純度較高。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在含TGF-β1和IGF-Ⅰ的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)后體外擴(kuò)增能力明顯降低，誘導(dǎo)21d后形態(tài)變化比較顯著，Ⅱ型膠原免疫組化染色明顯。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心法可成