miRNA-451在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖—遷移表型轉(zhuǎn)換中的開關(guān)作用.pdf

1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)是侵襲性最強(qiáng)的惡性膠質(zhì)瘤，也是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，屬人類預(yù)后極差的腫瘤之一[1]。如果僅進(jìn)行支持治療，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的中位生存期不足3個(gè)月，97％的病人在12月內(nèi)死亡;對于手術(shù)治療病人，由于腫瘤細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)呈彌漫浸潤性生長，常不能實(shí)現(xiàn)滿意的擴(kuò)大切除。面對并不樂觀的現(xiàn)狀，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)工作者依然不懈的致力于對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療手段的研究。近十余年來，微創(chuàng)理念和影像導(dǎo)引外科等新技術(shù)的

2、不斷發(fā)展，顯著提高了惡性腦腫瘤影像學(xué)全切除率，并降低了術(shù)后致殘、致死率，同時(shí)各種改良的綜合治療措施和新療法也為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療帶來了新希望。目前，盡管腫瘤切除手術(shù)后替莫唑胺(temozolomide，TMZ)聯(lián)合常規(guī)分割照射的標(biāo)準(zhǔn)治療方案有了值得關(guān)注的發(fā)展[2]，接受標(biāo)準(zhǔn)方案治療的新診斷的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者相對于單純放療的患者二年生存率由10.9％提高到27.2％，三年生存率由4.4％提高到16％，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲遷移生物學(xué)特性依然

3、嚴(yán)重制約著各種治療手段的進(jìn)一步提高。
　　腫瘤細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。早在1996年就有研究提出了腫瘤細(xì)胞的“go or grow”假說[3，4]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞所處的局部微生態(tài)環(huán)境不利于腫瘤細(xì)胞的增殖時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)遷移至適宜腫瘤細(xì)胞生存和增殖的環(huán)境。在這一過程中，腫瘤細(xì)胞在適合的微環(huán)境中進(jìn)行增殖與遷移表型的轉(zhuǎn)換，啟動(dòng)相應(yīng)的生物學(xué)變化。盡管對腫瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和增殖轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)制還很不清楚，但腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與增殖表型轉(zhuǎn)換肯定不是受

4、外部因素單獨(dú)影響的，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)兩種表型復(fù)雜的分子和信號通路調(diào)控之間，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)該存在一個(gè)表觀遺傳學(xué)的調(diào)控開關(guān)。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，對基因表達(dá)進(jìn)行抑制性調(diào)控，調(diào)節(jié)包括增殖，分化，凋亡等多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。最近研究表明，miR-451在遷移運(yùn)動(dòng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中明顯下調(diào)，miR-451調(diào)節(jié)KB1-AMPK通路，可能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞在不同的萄萄糖環(huán)境中分別表現(xiàn)出增殖活性

5、和遷移運(yùn)動(dòng)活性[6]。
　　本研究主要討論miR-451對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的作用，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白mTOR和遷移調(diào)控蛋白Rac1活性的影響，以及miR-451調(diào)控AMPK，mTOR， Rac1蛋白的激活狀態(tài)的潛在機(jī)制。
　　本課題研究分為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分明確miR-451在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，觀察miRNA-451對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的影響。我們收集40例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ)標(biāo)本以及6

6、例顳葉癲癇手術(shù)患者的對照腦組織。本課題組運(yùn)用qRT-PCR檢測不同標(biāo)本中miR-451的表達(dá)情況。通過將miR-451類似物和抑制物轉(zhuǎn)染U87、U251、SNB19三個(gè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，探討miRNA-451對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力的作用。qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果;MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性;體外劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中miR-451的相對表達(dá)量是對照腦組織的(33.58±

7、5.19)％;MTT實(shí)驗(yàn)表明miR-451對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力呈正性調(diào)節(jié)作用;劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-451對膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力呈負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分miR-451對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及運(yùn)動(dòng)能力作用的潛在機(jī)制。1.課題組將miR-451類似物和抑制物轉(zhuǎn)染進(jìn)入U(xiǎn)87、U251、SNB19三個(gè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果;western blot技術(shù)檢測不同處理組細(xì)胞中p-AMPK、AM

8、PK、p-Raptor、Raptor、Rac1的表達(dá);GST-pulldown技術(shù)檢測GTP-Rac1表達(dá)。結(jié)果顯示:各組細(xì)胞中AMPK、Raptor、Rac1的表達(dá)與miR-451的表達(dá)無明確相關(guān)性;p-AMPK、GTP-Rac1的表達(dá)量與miR-451表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與p-Raptor的表達(dá)呈正相關(guān)。2.為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論，我們通過RNA干擾技術(shù)沉默U87、U251、SNB19三個(gè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中AMPKa1的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染m

9、iR-451類似物和抑制物，qRT-PCR和western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果;MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性;體外劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力;western blot技術(shù)檢測不同處理組中p-AMPK、AMPK、p-Raptor、Raptor、Rac1的表達(dá);GST-pulldown技術(shù)檢測GTP-Rac1表達(dá)。結(jié)果顯示:敲低AMPKa1后，miR-451對細(xì)胞增殖，遷移能力及相關(guān)蛋白p-Raptor、GTP-