COLd-FX對不同狀態(tài)下小鼠脾細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)特性的研究.pdf

1、目的:在東方國家的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)體系里，對植物預(yù)防與治療疾病作用的探索已有數(shù)千年的歷史。然而在過去的二十年間里，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對藥物作用機(jī)制研究技術(shù)的成熟，針對西洋參的藥用價(jià)值及其機(jī)理的探索變得熱門起來。其間一些令人振奮的研究成果逐步報(bào)道于世。據(jù)報(bào)道，西洋參的主要成分為多糖和人參皂甙，一些研究指出西洋參的多糖成分比人參皂甙有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。COLD-FX是以人參多糖為主要成分的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品，據(jù)報(bào)道它具有刺激B淋巴細(xì)胞提升免疫球蛋白和

2、激活外周吞噬細(xì)胞的作用。同時(shí)，關(guān)于COLD-FX作用機(jī)制的相反報(bào)道也隨之顯現(xiàn)。此外，幾項(xiàng)大規(guī)模對西洋參制品的臨床研究結(jié)果也不相一致。這些結(jié)果提示著可能存在一些不明顯的因素導(dǎo)致這種矛盾的結(jié)果的出現(xiàn)。本研究探索西洋參制品COLD-FX作用于不同狀態(tài)下小鼠脾臟細(xì)胞后基因水平的變化。該研究將為進(jìn)一步研究COLD-FX具體的作用機(jī)制提供線索。
　　 方法:
　　 1.COLD-FX由商業(yè)途徑購得。使用磷酸鹽緩沖液將藥物粉末稀釋到目

3、標(biāo)濃度使用。
　　 2.免疫抑制小鼠細(xì)胞模型的建立
　　 實(shí)驗(yàn)使用7周齡的C57BL/6小鼠，使用無菌操作技術(shù)將小鼠脾臟取出，裂解脾臟獲得脾細(xì)胞后通過使用添加含地塞米松的細(xì)胞培養(yǎng)基對脾細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同濃度的地塞米松處理組，通過統(tǒng)計(jì)分析后得出地塞米松的最佳模型濃度。使用含地塞米松最佳模型濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞2小時(shí)以建立細(xì)胞模型。模型建立后通過離心法去除地塞米松并用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞團(tuán)塊從而得到可以使用的模型細(xì)

4、胞。
　　 3.處理組
　　 實(shí)驗(yàn)使用的脾細(xì)胞分為四個(gè)不同處理組:1）、正常脾細(xì)胞組，使用磷酸鹽緩沖液處理作為空白對照組;2）、正常刺激組，使用ConA處理（終濃度為1μg/孔）;3）、單純免疫抑制組，使用地塞米松處理（使用終濃度為20ng/ml，處理2小時(shí)）;4）、免疫抑制刺激組，使用地塞米松（使用終濃度為20ng/ml，處理2小時(shí)）和ConA（終濃度為1μg/孔）。在研究COLD-FX作用時(shí)，各組均加入COLD-FX

5、（終濃度為500ng/well）并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。
　　 4.MTT檢測
　　 提取后的小鼠脾細(xì)胞用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。MTT試驗(yàn)對COLD-FX處理后各組淋巴細(xì)胞增殖性能進(jìn)行測定。通過計(jì)算細(xì)胞增殖率比較各組的細(xì)胞增殖活性。
　　 5.流式細(xì)胞儀分析
　　 細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀分析各處理組中含CD3，CD4，CD8和CD25的細(xì)胞亞型的

6、組成比。收集培養(yǎng)的細(xì)胞并標(biāo)記特異性的抗小鼠細(xì)胞抗體，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，使用BDLSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。各組檢測結(jié)果由FlowJo軟件分析后得出。
　　 6.Microarray基因檢測
　　 使用Illumina基因表達(dá)平臺，Microarray技術(shù)檢測COLD-FX作用于不同狀態(tài)下小鼠脾臟細(xì)胞后基因表達(dá)水平。
　　 7.Real-timePCR分析Ifng等基因的表達(dá)水平
　　 實(shí)驗(yàn)所需探針從L

7、ifeTechnologies訂購。使用ABI7900Real-timePCR系統(tǒng)。基因表達(dá)水平變化由ddCt方法分析得出。
　　 結(jié)果:
　　 1.各處理組脾細(xì)胞增殖特性的結(jié)果
　　 MTT結(jié)果顯示單純免疫抑制組的吸光光度值(0.142±0.002)低于正常組(0.203±0.006)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;免疫抑制刺激組的吸光光度值(0.532±0.008)低于正常刺激組(0.717±0.015

8、)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2.COLD-FX處理對各組脾細(xì)胞增殖特性的影響
　　 細(xì)胞增殖率在免疫抑制組(17.31±0.03)增加的幅度比正常組(10.18±0.06)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。COLD-FX處理后，免疫抑制組(17.31±0.03)和免疫抑制刺激組(24.91±0.3)的細(xì)胞增殖率分別比正常組(10.18±0.06)和正常刺激組(11.92±0.07)高，差異有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.COLD-FX對T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響結(jié)果顯示4組的變化不相一致。但是在抑制組中CD25(82.3±0.2)表達(dá)和CD4/CD8比率(2.39)明顯較COLD-FX處理前高，處理前CD25為(30.8±0.45),CD4/CD8比率為1.59。在免疫抑制刺激組中CD3由(52.1±0.05)降為(33.2±0.4)而CD25由(72.6±0.25)降為(27.8±1.75)。
　

10、　 4.COLD-FX處理后各組基因表達(dá)情況
　　 結(jié)果顯示只有單純組對COLD-FX處理有反應(yīng)，在單純免疫抑制組許多基因表達(dá)受影響。而單純免疫抑制組和對正常對照組前10位表達(dá)變化的基因中只有3個(gè)共同的基因變化一致，即Slpi和Wnt10a表達(dá)上調(diào)，Hbb-b1表達(dá)下調(diào)。使用DAVIDBioinformaticsResource對基因進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)在正常組，1組基因表達(dá)上調(diào)，在免疫抑制組有5組基因變化明顯（見表1），其中1組

11、基因表達(dá)上調(diào)，3組基因下調(diào)。
　　 5.Real-timePCR驗(yàn)證Ifng基因的表達(dá)
　　 COLD-FX處理后Ifng基因在各處理組中的表達(dá)變化不一致，其中Microarry檢測發(fā)現(xiàn)其在正常組中表達(dá)明顯低下，這一結(jié)論得到Real-timePCR的證實(shí)。
　　 結(jié)論:
　　 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4個(gè)處理組的小鼠脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖活性和生物標(biāo)記具有差別。Microarray檢測結(jié)果表明，正常細(xì)胞組基因表達(dá)和其它各處