鴨胚原代肝細(xì)胞抗乙肝模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎是一種世界范圍內(nèi)流行的嚴(yán)重傳染病,目前尚無(wú)根治的特效藥物和方法。由于乙肝病毒(HBV)宿主范圍窄,建立細(xì)胞及動(dòng)物模型比較困難,大大限制了抗HBV藥物的發(fā)展。因此,建立一種簡(jiǎn)便、有效的乙肝模型對(duì)于深入研究肝炎的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型抗乙肝藥物具有重要意義。
　　本課題以紹興麻鴨受精卵孵化的感染鴨胚為原材料,探索了鴨胚肝細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)技術(shù),建立了基于鴨胚原代肝細(xì)胞的鴨乙肝病毒(DHBV)DNA的熒光定量PCR檢測(cè)方法,并利用

2、建立的鴨胚原代肝細(xì)胞模型研究了幾種天然提取物的抗乙肝活性,從而驗(yàn)證了該模型的特異性、靈敏性和可行性。
　　1.鴨胚肝細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)采用紹興麻鴨受精卵孵化的鴨胚作為材料,首先利用普通PCR技術(shù)篩選出先天感染陽(yáng)性鴨胚,然后以先天陽(yáng)性鴨胚為基礎(chǔ)進(jìn)行細(xì)胞模型的構(gòu)建。具體是通過(guò)以下幾方面條件的優(yōu)化:(1)鴨胚胚齡的選擇:選擇15、16、17、18、19、20、21、22、23、24日的鴨胚進(jìn)行比較,結(jié)果表明18-22日齡的鴨胚效果較好

3、;(2)胰酶消化液濃度及時(shí)間的選擇:選擇濃度為0.15％,0.25%,0.35%,消化時(shí)間分別為5min、10min、15min進(jìn)行比較,結(jié)果表明濃度為0.25%的胰酶濃度,消化時(shí)間10min時(shí),效果最佳;(3)離心轉(zhuǎn)速大小的選擇:選擇1000r、3000r、5000r、7000r的轉(zhuǎn)速進(jìn)行比較,結(jié)果表明3000r或5000r效果較好;(4)胎牛血清的濃度選擇:選擇胎牛血清的濃度為5%、10%、15%、20%進(jìn)行比較,結(jié)果表明血清濃度為

4、10%時(shí)即可滿(mǎn)足原代細(xì)胞培養(yǎng)需要;(5)進(jìn)口血清和國(guó)產(chǎn)血清的選擇:選擇GIBCOTM的血清與國(guó)產(chǎn)四季青血清進(jìn)行對(duì)比,在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h分別進(jìn)行觀(guān)察,結(jié)果表明國(guó)產(chǎn)血清與進(jìn)口血清的生長(zhǎng)情況沒(méi)有大的差別,出于經(jīng)濟(jì)考慮選擇國(guó)產(chǎn)血清;(6)冰浴時(shí)間的選擇:分別選擇5min、10min、15min、20min、25min的冰浴時(shí)間,結(jié)果表明冰浴時(shí)間選擇15min或20min,細(xì)胞生長(zhǎng)情況較好;(7)培養(yǎng)基的選擇:選擇RP

5、MI Medium1640和DMEM兩種培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明兩種培養(yǎng)基在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)差別不大;(8)生長(zhǎng)因子的選擇:選擇胰島素和氫化可的松琥珀酸氫鈉兩種生長(zhǎng)因子分別進(jìn)行添加和共同添加,結(jié)果表明在兩種生長(zhǎng)因子共同添加的時(shí)候效果最好;(9)細(xì)胞接種密度的選擇:選擇2×105copies.mL-1,4×105copies.mL-1,6×105copies.mL-1,8×105copies.mL-1,10×105copies.mL-1五種

6、密度進(jìn)行比較,結(jié)果表明(4-8)×105copies.mL-1的密度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)較好。
　　通過(guò)對(duì)鴨胚肝細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)條件的摸索和優(yōu)化,確立了鴨胚肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法和最優(yōu)參數(shù),為抗乙肝藥物評(píng)價(jià)模型的建立打下了基礎(chǔ)。
　　2.鴨胚肝細(xì)胞中鴨乙肝病毒DNA定量檢測(cè)方法的建立為了建立準(zhǔn)確、快速、特異的DHBV-DNA SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法,我們采用了一對(duì)跨越DHBV基因組正負(fù)兩鏈的特異性引物,并且將DH

7、BV基因組擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到了PMD-18T載體上,然后以該重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行梯度稀釋,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),進(jìn)行了特異性、靈敏性、重復(fù)性分析。結(jié)果表明,建立的方法可以特異性定量檢測(cè)DHBV-DNA,在1.0×102-1.0×108 copies·μL-1范圍內(nèi)具有較好的線(xiàn)性關(guān)系,擴(kuò)增效率為103.8%,相關(guān)系數(shù)r2為0.995,靈敏度為1.0×102copies·μL-1,重復(fù)性檢驗(yàn)差異最大系數(shù)為3.03%。因此,建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有

8、特異性、靈敏性、準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn),完全可以用于DHBV-DNA的定量檢測(cè)和抗乙肝病毒藥物的篩選與評(píng)價(jià)。
　　3.基于鴨胚肝細(xì)胞模型的天然產(chǎn)物抗乙肝活性評(píng)價(jià)采用已建立的基于鴨胚原代肝細(xì)胞的抗乙肝藥物評(píng)價(jià)模型,以拉米夫定作為陽(yáng)性對(duì)照藥物,研究3種天然提取物對(duì)DHBV-DNA復(fù)制的影響,以驗(yàn)證模型的可靠性。結(jié)果表明:(1)蒲公英提取物處理鴨胚肝細(xì)胞后,對(duì)感染肝細(xì)胞DHBV-DNA復(fù)制具有不同程度抑制作用,且隨著時(shí)間延長(zhǎng),抑制作用逐漸增強(qiáng)。在

9、作用3天后,50-100μg/ml劑量對(duì)DHBV-DNA具有顯著抑制作用(P<0.01),在作用6天后,1-100μg/ml劑量對(duì)DHBV-DNA均有顯著抑制作用(P<0.01),且100μg/ml劑量的抑制作用優(yōu)于藥物拉米夫定。(2)菊苣酸作用鴨胚肝細(xì)胞3天后,25-100μg/ml劑量顯著降低了DHBV-DNA水平(P<0.01),在作用6天后,1-100μg/ml劑量顯著降低了DHBV-DNA水平(P<0.01)。(3)齊墩果酸作

10、用鴨胚肝細(xì)胞3天后,10-100μg/ml劑量顯著抑制了DHBV-DNA復(fù)制(P<0.01),在作用6天后,1-100μg/ml劑量顯著抑制了DHBV-DNA復(fù)制(P<0.01)。
　　總之,本論文以鴨胚原代肝細(xì)胞為基礎(chǔ),研究了鴨胚肝細(xì)胞中DHBV-DNA的熒光定量PCR檢測(cè)方法,建立了一種基于鴨胚原代肝細(xì)胞的抗乙肝藥物評(píng)價(jià)模型,并運(yùn)用此模型開(kāi)展了幾種天然產(chǎn)物的抗乙肝作用研究。該模型的建立為今后深入研究乙肝的發(fā)病機(jī)制和篩選新型抗乙