大口黑鱸肝細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的建立及其應(yīng)用于CYP450的誘導(dǎo)研究.pdf

1、本論文從水產(chǎn)動(dòng)物肝臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)入手，篩選出一最適的肝臟組織，在此基礎(chǔ)上建立一種穩(wěn)定的肝細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞應(yīng)用于藥物代謝酶的誘導(dǎo)研究，以期為藥物代謝酶的體外誘導(dǎo)研究奠定基礎(chǔ)。 采用組織塊法和消化法比較研究了草魚、鳊魚、鯽魚、鯉魚、鱸魚、鱘魚、(魚回)魚、甲魚等水產(chǎn)動(dòng)物肝臟組織的原代培養(yǎng)，其中消化法比較研究不同胰蛋白酶濃度及消化時(shí)間對(duì)細(xì)胞分離效果的影響，以消化的難易程度、消化所得細(xì)胞的數(shù)量及活力等參數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)

2、，最終篩選出鱸魚肝臟為最適宜的肝細(xì)胞原代培養(yǎng)組織。進(jìn)一步優(yōu)化肝細(xì)胞的分離方法和培養(yǎng)條件，建立了在本實(shí)驗(yàn)室條件下大規(guī)模、長(zhǎng)期培養(yǎng)原代肝細(xì)胞的方法。通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中LDH、ALb含量等指標(biāo)的檢測(cè)，確定了肝細(xì)胞功能表達(dá)的最佳時(shí)期，并將其應(yīng)用于藥物代謝酶的誘導(dǎo)研究。 結(jié)果表明：(1)肝臟組織的篩選；通過(guò)采用組織塊法和消化法對(duì)草魚、鳊魚、鯽魚、鯉魚、鱸魚、鱘魚、(魚回)魚、甲魚等水產(chǎn)動(dòng)物肝臟組織原代培養(yǎng)的比較研究，組織塊法均未見(jiàn)

3、細(xì)胞從組織塊中遷出，該法不適合肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)；消化法分離肝細(xì)胞，其中鱸魚肝組織獲得最佳分離效果，0.25％胰蛋白酶消化20min，每克肝重可獲得0.9×106個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞活力達(dá)到89％，通過(guò)短期培養(yǎng)，初步判定鱸魚的肝臟組織適于本實(shí)驗(yàn)室條件下體外分離消化，并可大規(guī)模培養(yǎng)。(2)鱸魚肝細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的建立；胰蛋白酶濃度0.25％，消化時(shí)間20min，分步收集肝細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平均活力＞90％，每克肝重可獲得3×106

4、個(gè)分離肝細(xì)胞。在細(xì)胞活力和數(shù)量?jī)煞矫孢_(dá)到最佳平衡。在含20％胎牛血清、10μg/mL胰島素的M199/L15培養(yǎng)基中，于4％CO2，28℃培養(yǎng)箱中長(zhǎng)期培養(yǎng)并可傳代。(3)鱸魚原代肝細(xì)胞損傷和代謝能力的檢測(cè)；鱸魚肝細(xì)胞在培養(yǎng)觀察14d的過(guò)程中，在3-4d內(nèi)LDH滲出量增加，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其分泌量呈下降趨勢(shì)。白蛋白的分泌量在培養(yǎng)的3-5d中呈上升趨勢(shì)，在4-8d維持一較高水平，此后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，白蛋白逐漸減少。綜合LDH滲出量、

5、ALb分泌量的變化，選擇培養(yǎng)至第5d的鱸魚原代肝細(xì)胞應(yīng)用于藥物代謝酶的檢測(cè)。(4)CYP450的誘導(dǎo)研究；取培養(yǎng)至第5d的鱸魚原代肝細(xì)胞應(yīng)用于CYP450酶系中的氨基比林-N-脫甲基酶的誘導(dǎo)研究，以利福平為誘導(dǎo)劑，氨基比林為底物，40μmol利福平誘導(dǎo)24h后，鱸魚原代肝細(xì)胞中氨基比林-N-脫甲基酶活性最高，初步判定其由CYP3A4，CYP2C9介導(dǎo)。 隨著人們對(duì)藥物使用安全性的認(rèn)識(shí)由以前的“靶動(dòng)物安全，”到“食品安全”的轉(zhuǎn)變，