轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1基因沉默對(duì)人涎腺粘液表皮樣癌Ms細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、人涎腺粘液表皮樣癌(MucoepidermoidCaecinoma，MEC)來(lái)源于涎腺導(dǎo)管上皮，是口腔頜面部較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，低分化的涎腺粘液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，而腫瘤轉(zhuǎn)移往往是腫瘤患者死亡的主要原因。涎腺粘液表皮樣癌的治療目前仍主要以傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療為主，但療效欠佳，尤其是低分化型粘液表皮樣癌患者，5年生存率低。因此探索新的療法，尤其是如何抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移尤為重要，以期提高對(duì)涎腺粘液表皮樣癌的療效。 RNA干擾(R

2、NAinterference，RNAi)是特異基因表達(dá)沉默的強(qiáng)有力手段之一，廣泛存在于從真菌到植物，從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的多種生物體中。自1998年Fire命名RNA干擾以來(lái)，RNAi研究進(jìn)展很快，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門(mén)的研究課題之一。近年來(lái)研究表明，RNAi技術(shù)在腫瘤、病毒感染性疾病和某些功能獲得性遺傳疾病的治療中具有巨大的應(yīng)用潛力；RNAi用于腫瘤治療較之先前的腫瘤基因治療方法具有高度的特異性，高效率，存在放大效應(yīng)，作用廣泛并可

3、遺傳的特點(diǎn)。因此針對(duì)癌基因在腫瘤細(xì)胞中引發(fā)RNAi效應(yīng)，將有可能開(kāi)辟腫瘤基因治療的新途徑。 本研究以人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移Ms細(xì)胞為研究對(duì)象，首次探討利用RNAi技術(shù)沉默轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β1)基因后對(duì)Ms細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。首先采用基因芯片技術(shù)篩選涎腺粘液表皮樣癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)TGF-β1在Ms細(xì)胞中高表達(dá)。TGF-β1是TGF-β家族最

4、重要的成員之一，可刺激腫瘤組-3-織內(nèi)新生血管形成，促進(jìn)ECM的合成，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；還可刺激瘤細(xì)胞分泌蛋白酶，增強(qiáng)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)能力；增加粘附蛋白、糖蛋白等細(xì)胞外間質(zhì)成分聚集，有助于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等多數(shù)腫瘤中均可觀察到TGF-β1的高表達(dá)，且與侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，但與人涎腺粘液表皮樣癌的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以TGF-β1為靶基因，主要研究方法和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：1.T

5、GF-β1在人涎腺粘液表皮樣癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)人類(lèi)基因組分類(lèi)芯片(BioStarH-I)篩選MEC-1細(xì)胞及Ms細(xì)胞差異表達(dá)基因，選定靶基因TGF-β1，用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot進(jìn)一步檢測(cè)TGF-β1在MEC-1細(xì)胞和Ms細(xì)胞中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示TGF-β1在Ms細(xì)胞中高表達(dá)。 2.TGF-β1shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-β1基因的shRNA，構(gòu)建

6、pWH1-TGF-β1真核表達(dá)載體，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Ms細(xì)胞，600μg/mlG418篩選21d。用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1shRNA后TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平被顯著抑制。 3.TGF-β1shRNA對(duì)Ms細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響應(yīng)用光鏡和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TGF-β1shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞體積較大，多核巨核細(xì)胞少見(jiàn)，表面微絨毛較少，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡變性，

7、線(xiàn)粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核漿比例變小，核仁減小，數(shù)目減少，核分裂像減少。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定、克隆形成試驗(yàn)、裸鼠頜下腺原位移植瘤等方法，發(fā)現(xiàn)用TGF-β1shRNA轉(zhuǎn)染Ms細(xì)胞使細(xì)胞體外和裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)受到抑制。細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別為29.0h，28.8h，27.1h。TGF-β1shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Ms細(xì)胞軟瓊脂克隆形成抑制率為54.5％；平板克隆形成抑制率為43.4％；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示S期和G2期細(xì)胞比

8、例下降，PI值下降了17.4％；裸鼠頜下腺原位移植瘤抑制率為59.0％。 4.TGF-β1shRNA對(duì)Ms細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移特性的影響同質(zhì)粘附試驗(yàn)顯示隨著振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)，粘附細(xì)胞逐漸增多。Ms細(xì)胞轉(zhuǎn)染了TGF-β1shRNA后，30min同質(zhì)粘附率升高了18.6％；細(xì)胞在-4-Matrigel和FN基質(zhì)表面上1h的粘附率為39.5％和35.3％；體外遷移試驗(yàn)顯示細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的移動(dòng)抑制率為37.7％；體外侵襲試驗(yàn)顯示侵

9、襲抑制率為37.3％；明膠電泳法檢測(cè)結(jié)果表明基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2活性降低，MMP-9活性無(wú)明顯變化；裸鼠肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率為47.6％。 5.TGF-β1shRNA對(duì)Ms細(xì)胞Ki-67、VEGF和uPA蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用免疫熒光和免疫組化法檢測(cè)Ki-67、VEGF和uPA蛋白表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn)，Ms細(xì)胞轉(zhuǎn)染了TGF-β1shRNA后，Ki-67、VEGF和uPA蛋白的表達(dá)顯著降低。 結(jié)論：1.TGF-β1基因沉默可導(dǎo)致Ms

10、細(xì)胞增殖能力、體外遷移和侵襲能力降低，并能有效抑制Ms細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，提示TGF-β1與Ms細(xì)胞的增殖及高轉(zhuǎn)移性有關(guān)； 2.TGF-β1基因沉默后Ms細(xì)胞增殖能力，轉(zhuǎn)移力下降，但不能完全遏制，提示腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因多因素調(diào)控的過(guò)程； 3.轉(zhuǎn)染TGF-β1shRNA的Ms細(xì)胞Ki-67、VEGF和uPA的蛋白表達(dá)均下降，提示TGF-β1和Ki-67、VEGF及uPA在Ms細(xì)胞中的表達(dá)存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。 4.TGF-β