豬戊型肝炎病毒上海株全基因組測序及上海地區(qū)動物抗體檢測.pdf

1、用北京萬泰生物藥業(yè)有限公司提供的動物用總抗戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)抗體試劑盒，采用雙抗原夾心法，檢測采自上海7個區(qū)7個規(guī)模豬場的4、9和18周齡生長豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬血清樣品共252份，8個奶牛場的奶牛血清樣品96份，寵物門診寵物犬血清樣品43份，農(nóng)貿(mào)市場雞血清樣品20份，鴨血清樣品24份，上海野生動物園野天鵝等珍禽血清樣品35份，以了解上海地區(qū)HEV抗體在以上 動物中的分布情況。結(jié)果表明：88.

2、8％(222/252)的豬，27.9％(12/143)的寵物犬， 23.9％(23/96)的奶牛，檢測到HEVIgG，雞，鴨，珍禽沒有檢測到HEVIgG。4、9和 18周齡豬、后備母豬及經(jīng)產(chǎn)母豬抗體水分別為2.01±1.46、1.27±0.77、1.65±1.40、2.81±1.34、2.85±1.23；抗體陽性率分別為85.8％(42/49)、84.3％(59/70)、80.9％(52/63)、97.1％(34/35)、100.0％

3、(35/35)。豬場和奶牛場的場陽性率均為100％。表明上海地區(qū)豬群感染HEV很普遍，奶牛和寵物犬感染HEV的比例也很可觀。根據(jù)不同基因型的HEV ORF<,2>中507bp保守序列設(shè)計兼并引物，用逆轉(zhuǎn)錄套式聚合酶鏈方法(Reverse transcription nested polymerase chain reaction，RT-nPCR)檢測豬糞中HEV RNA。在上海市九個區(qū)中，每區(qū)隨機抽取2個規(guī)模豬場，每場收集18份2-3月

4、齡豬的糞樣，對其中13個豬場每場隨機采集13份1月齡以下豬的糞樣，4個豬場每場采集母豬糞17份，共計561份。從新疆三個地區(qū)五個豬場隨機采集2-3月齡豬糞98份(部分檢測)。結(jié)果表明，HEV RNA陽性率1月齡豬糞樣品為8.2％(14/169)，陽性場率為15.4％(2/13)；2-4月齡豬糞樣品陽性率為16.9％(55/324)，陽性場率為72.2％(13/18)；母豬糞樣品陽性率為17.6％(12/68)，陽性場率為75％(3/4)

5、。將PCR擴增產(chǎn)物克隆pMD-18T載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并將6個上海、3個新疆重組質(zhì)粒測序，用DNASTAR軟件進行同源性分析，Clustalx和Mega3.0軟件繪制基因進化樹。與53個豬源和人源HEV相比，6個上海株507bp與Ⅳ型的核苷酸同源性為85.6％～88.2％，與Ⅲ、Ⅱ、I型為76.6％～82.5％，6個上海株間的核苷酸同源性為 94.1％～99.0％。3個新疆株507bp與Ⅳ型的核苷酸同源性為84.6％～90.4％

6、，與Ⅲ、Ⅱ、I型為76.8％～81.7％，3個新疆株間的核苷酸同源性為86.1％～98.2％。6個上海株與3個新疆株間的核苷酸同源性為85.7％～88.0％。9株HEV都屬于IV型。與兩年前20個新疆豬HEV ORF<,2>中的348bp序列相比，一株新疆豬HEV株與來自同一地域的7株豬HEV核苷酸同源性為93.6～94.5％。基于348bp和507bp構(gòu)建的進化樹都顯示6個上海株聚在一起，而3個新疆株分為兩支，一株與兩年前的新疆株相隔

7、較近，其它兩株聚合形成獨立的分支。表明豬HEV時空上存在程度不同的變異。設(shè)計22對PCR引物分片段擴增豬HEV上海株swChinash全基因組，對兩末端采用快速擴增方法(RACE)進行擴增，擴增產(chǎn)物克隆到pMDl8-T載體并測序。用DNASTAR軟件進行同源性分析，Clustalx和Mega3.0軟件繪制基因進化樹。在全基因組和ORF<,1-3>的基礎(chǔ)上比較上海株與53株人源和豬源HEV的基因組的差異，進行基因分型。swChinash全

8、序列除去3’poly(A)尾，由7235個核苷酸組成，ORF<,1，2，3>分別編碼1707，660，122個氨基酸。全基因序列與Ⅳ型的核苷酸同源性為83.4‰84.7％，其中與中國人源長春株(china8)最高，與其他三型為73.3％-76.3％。ORF<,1>與Ⅳ型的核苷酸同源性為80.5％～84.1％，與其他三型為70.8％-74.1％；氨基酸同源性分別為92.6％～94.5％和80.9％～85.7％。ORF<,2>與Ⅳ型的核苷酸

9、同源性為83.8％-86.9％，與其他三型為78.3％～81.2％；氨基酸同源性分別為947％-98.0％和89.4％～93.7％。ORF<,3>與Ⅲ型的核苷酸同源性為89.8％-91.3％，與Ⅳ、Ⅱ、Ⅰ三型為84.9％～88.4％，氨基酸同源性與Ⅳ型為87.6％-93.0％，與Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ三型為77.2％～84.6％?；谌L基因組和ORF<,1-3>的進化樹表明該豬源HEV屬于基因Ⅳ型，但是其變異較大(15.3％～16.6％)，單獨在