軟骨細胞與靜電紡絲PCL支架灌流培養(yǎng)構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、先天性缺陷、退行性疾病（骨性關(guān)節(jié)炎）和創(chuàng)傷都會造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷。由于缺乏血管供應(yīng)、神經(jīng)支配以及淋巴回流，關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復再生能力極弱。傳統(tǒng)的外科治療包括骨膜移植術(shù)、自體軟骨移植術(shù)和骨髓刺激術(shù)等，但都存在臨床預后差、可修補范圍有限、組織功能低下及疾病傳播風險等缺陷。軟骨組織工程技術(shù)通過聯(lián)合細胞治療（軟骨細胞、成人干細胞）、合適的生物材料支架（天然材料、人工合成材料）以及多種生長和分化刺激因子，構(gòu)建出功能化的體外軟骨組織并最終移植至缺

2、損部位，為解決軟骨損傷難題帶來了希望。
　　 種子細胞及支架選取是組織工程研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，不同的種子細胞在不同的支架生長表現(xiàn)出不同的生物學特性。軟骨細胞作為種子細胞已廣泛應(yīng)用于三維支架和生物反應(yīng)器研究中。靜電紡絲技術(shù)(Electrospinning)（簡稱“電紡”）可以制造出微米級和納米級的纖維多孔支架，纖維精細度高，與天然細胞外基質(zhì)(ExtracellularCellMatrix，ECM)纖維形態(tài)及分布相似，且孔隙率高、表

3、面積體積比大，在組織工程支架制造領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，并廣泛開展于骨、軟骨、血管和神經(jīng)組織再生研究。聚已內(nèi)酯(Polycarpolaction，PCL)作為生物相容性及生物可吸收性好的人工合成生物材料，在越來越多的組織工程研究中使用，包括軟骨組織工程。
　　 力學刺激是關(guān)節(jié)軟骨生長發(fā)育的必備條件，種子細胞缺乏力學刺激，分泌軟骨ECM的能力會很弱。動態(tài)的培養(yǎng)環(huán)境可以促進營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運輸循環(huán)，提高細胞的增殖和ECM合成能力

4、。ECM維持著軟骨的結(jié)構(gòu)和功能，因而細胞生物力學的研究越來越受到重視。各種生物反應(yīng)器(Bioreactor)的研發(fā)和使用提供了仿生的力學刺激。灌流培養(yǎng)生物反應(yīng)器(Flowperfusionbioreactor)將帶有分化因子的培養(yǎng)基液體持續(xù)循環(huán)通過支架-細胞復合物，同時提供了剪切力和流體壓力刺激，模仿了天然活動關(guān)節(jié)的力學環(huán)境。
　　 由于本身所特有的結(jié)構(gòu)和機械特性，靜電紡絲支架聯(lián)合生物反應(yīng)器的研究較少。靜電紡絲支架的纖維直徑、孔

5、徑和孔隙率等結(jié)構(gòu)參數(shù)都影響著局部力學環(huán)境的建立。在灌流生物反應(yīng)器中，灌流速率的設(shè)置是影響力學刺激施加的獨立參數(shù)，因而不同結(jié)構(gòu)參數(shù)的靜電紡絲支架加載于不同灌流速率的灌流反應(yīng)器中會帶來不同的力學刺激，從而影響著細胞的活性及功能。探尋能夠維持細胞活力并提供最佳力學刺激的灌流速率一直是灌流培養(yǎng)研究的目標。
　　 近年來學者們一直嘗試灌流生物反應(yīng)器和靜電紡絲支架聯(lián)合應(yīng)用于軟骨組織工程中，并取得了一定的成果。但如何設(shè)計制造出最匹配靜電紡絲纖

6、維膜的灌流生物反應(yīng)器，以及如何優(yōu)化靜電紡絲支架結(jié)構(gòu)參數(shù)和灌流速率以達到最佳培養(yǎng)效果等問題仍值得探入探討和研究。
　　 目的:本研究自行設(shè)計制造灌流生物反應(yīng)器，利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建微米級大孔徑PCL纖維多孔支架，提取原代兔軟骨細胞后接種于PCL支架并加載灌流培養(yǎng)。觀察灌流培養(yǎng)對靜電紡絲PCL支架中兔軟骨細胞增殖活性及ECM基質(zhì)合成能力的影響，驗證自制生物反應(yīng)器的可行性，尋求靜電紡絲技術(shù)和灌流生物反應(yīng)器的結(jié)合，并為下一步優(yōu)化生物反應(yīng)

7、器規(guī)格、灌流速率和靜電紡絲支架結(jié)構(gòu)參數(shù)，探討其對組織工程軟骨的影響規(guī)律提供基礎(chǔ)和經(jīng)驗。
　　 方法:利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建微米級纖維大孔徑PCL支架，行掃描電子顯微鏡(Scanningelectronmicroscope，SEM)觀察支架表面形態(tài)，ImageJ軟件計算纖維直徑和孔徑;自行設(shè)計制造灌流生物反應(yīng)器，控制灌流速率為0.5mL/min;分離培養(yǎng)新西蘭純種大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞（chondrocytes）并體外擴增至第三代(P

8、assage3，P3)，接種支架后分為灌流加載培養(yǎng)組(Perfusiongroup)和靜態(tài)培養(yǎng)組（Smilcgroup）。在培養(yǎng)第3、7、14天收獲支架-細胞復合物(Constructs)，行SEM觀察細胞粘附生長情況;DNA定量檢測細胞增殖活性;糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAG)定量、總膠原(Collagen，COL)定量檢測軟骨特異ECM分泌能力;培養(yǎng)第14天行Real-timePCR驗證成軟骨基因collag

9、enⅡ、collagenⅠ、aggrecan基因表達情況;培養(yǎng)第14天行冰凍組織切片蘇木精-伊紅（HE）染色和番紅O（SafraninO）染色觀察軟骨特異ECM分泌情況。
　　 結(jié)果:SEM觀察靜電紡絲PCL支架纖維直徑1.67±0.76μm，孔徑17.65±7.11μm;自制灌流生物反應(yīng)器密封性好，灌流速率精確穩(wěn)定，可重復組裝使用及高壓滅菌處理，無生物學毒性;SEM觀察支架-細胞復合物，可見靜電紡絲PCL支架中軟骨細胞粘附生長

10、良好，且灌流培養(yǎng)組增殖快于靜態(tài)培養(yǎng)組，較好的保持了軟骨細胞特征的圓形形態(tài)。在培養(yǎng)第7天，灌流培養(yǎng)組DNA定量為11.41±4.06μg/mL，高于靜態(tài)培養(yǎng)組3.67±1.08μg/mL(P＜0.05);在培養(yǎng)第3天和第7天，灌流培養(yǎng)組GAG定量為0.6097±0.1504μg/mL和1.9289±0.6256μg/mL，高于靜態(tài)培養(yǎng)組0.1253±0.0377μg/mL和0.1669±0.0566μg/mL(P＜0.01);在培養(yǎng)第14

11、天，灌流培養(yǎng)組GAG定量為1.2666±0.3763μg/mL，高于靜態(tài)培養(yǎng)組0.3566±0.0855μg/mL(P＜0.05)。在培養(yǎng)第3天和第7天，灌流培養(yǎng)組COL定量為0.084±0.0208μg/mL和0.1133±0.028μg/mL，高于靜態(tài)培養(yǎng)組0.0402±0.0033μg/mL和0.0433±0.0142μg/mL(P＜0.05)。在培養(yǎng)第3天，灌流培養(yǎng)組GAG/DNA比值為0.1747±0.0186，高于靜態(tài)培養(yǎng)組

12、0.0708±0.0184(P＜0.01);在培養(yǎng)第7天和第14天，灌流培養(yǎng)組GAG/DNA比值為0.1488±0.0313和0.0732±0.0116，高于靜態(tài)培養(yǎng)組0.0449±0.0029和0.0448±0.0101(P＜0.05)。在培養(yǎng)第14天，灌流培養(yǎng)組collagenⅡ、aggrecan基因表達增加(P＜0.05);軟骨分化指數(shù)(collagenⅡ/collagenⅠ)高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P＜0.05)。在培養(yǎng)第14天的冰凍組