脂肪基質(zhì)細(xì)胞向軟骨誘導(dǎo)分化及構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、戰(zhàn)時的復(fù)合型、多發(fā)性創(chuàng)傷以及平時各種外傷、骨關(guān)節(jié)病等均可造成全身各處軟骨損傷、破壞，直接影響患者的外貌和功能，其穩(wěn)定及便捷的修復(fù)對提高患者的生存質(zhì)量至關(guān)重要。隨著生活水平的提高，人們對美容的需求也日漸增長，應(yīng)用軟骨進(jìn)行的臨床整形美容治療是整形修復(fù)外科研究的熱點與難點。自體、同種異體軟骨以及人工替代材料不斷應(yīng)用于臨床，但它們存在來源受限、形態(tài)不匹配以及免疫排斥反應(yīng)等問題。組織工程學(xué)是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，研究和開發(fā)用于修復(fù)和改善人體

2、各種組織、器官損傷后的功能和形態(tài)的一門科學(xué)，它可以避免傳統(tǒng)治療方法的缺陷，是解決組織缺損的一項理想途徑。組織工程研究的兩個關(guān)鍵因素是良好的種子細(xì)胞以及合適的支架材料。目前應(yīng)用的種子細(xì)胞中，自體軟骨細(xì)胞來源有限，會造成機體附加損傷；同種異體軟骨細(xì)胞來源廣泛，獲取容易，但免疫排斥反應(yīng)較強；胚胎干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是種子細(xì)胞較佳的來源，但都受到倫理道德和取材數(shù)量的限制，使其在組織工程的應(yīng)用上難以推廣。支架材料方面，目前用于軟骨組織工程支架材

3、料主要有膠原海綿、纖維蛋白凝膠、聚丙交酯(polylactide,PLA)、聚乙交酯(polyglycolide,PGA)及其共聚物(Polylactide-co-glycolide,PLGA)等，它們存在或親水性差、細(xì)胞吸附力弱、降解慢，或免疫反應(yīng)大，價格昂貴等諸多缺點。
　　脂肪組織基質(zhì)中存在著具有自我更新和一定的多能分化潛能、處于全能細(xì)胞和成熟細(xì)胞之間的成體干細(xì)胞，稱為脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adiposetissue-derived

4、stromalcells,ADSCs）。ADSCs具有多向分化的潛能，能向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及神經(jīng)等細(xì)胞等定向誘導(dǎo)分化，從而參與組織的損傷修復(fù)。其容易獲取、采集效率高，對機體損傷小，是一種新型的組織工程種子細(xì)胞。羥丙甲基纖維素（Hydroxypropylmethylcellulose,HPMC）是一種無細(xì)胞毒，與機體相容性好，不誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)的熱敏性水凝膠，其降解速度與組織生長速度相匹

5、配，其可注射性及溫度敏感性為創(chuàng)傷修復(fù)治療和重建手術(shù)提供了方便、可塑性、微創(chuàng)的生物材料，是一種理想的組織工程生物支架材料。
　　脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）和羥丙甲基纖維素（HPMC）的聯(lián)合應(yīng)用為組織工程修復(fù)軟骨缺損提供了一個新的途徑與方法。
　　材料與方法：
　　1.人脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）的分離和培養(yǎng)
　　取第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院整形科超聲乳化后的脂肪組織溶液，經(jīng)消化、過濾、分離、培養(yǎng)得到ADSCs，加入培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)，觀察原代及傳代后細(xì)胞形態(tài)，并用MTT法繪制生長曲線。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物
　　取6代細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD105以及CD106等表面標(biāo)志。
　　3.人脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化
　　ADSCs消化傳代，用成軟骨培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)細(xì)胞，接種于新培養(yǎng)瓶中，隔日換液。觀察細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞爬片行免疫組化和AB/PAS染

7、色以及天狼猩紅染色。
　　4.成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建工程化軟骨
　　配制合適濃度的羥丙甲基纖維素（HPMC）與誘導(dǎo)細(xì)胞混和，分別注入3只裸鼠前后肢背部皮下，每只裸鼠有3個注射點為實驗組，1個注射點作為對照，注射不含細(xì)胞的凝膠。裸鼠分別于飼養(yǎng)3w、5w和7w處死取材，進(jìn)行組織和形態(tài)的觀察。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)與生長曲線
　　原代培養(yǎng)的ADSCs7d左右即達(dá)70％～80％融合，細(xì)胞呈漩渦狀排列。

8、經(jīng)體外培養(yǎng)10代以后，細(xì)胞的增殖速度減慢。成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞增殖速度顯著快于未誘導(dǎo)細(xì)胞。
　　用MTT法分別做ADSCs及成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞的生長曲線。ADSCs第3d進(jìn)入指數(shù)增長期，群體倍增時間為55h左右，細(xì)胞在第4d進(jìn)入平臺期；成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞第2d進(jìn)入指數(shù)增長期，群體倍增時間為30h左右，細(xì)胞增殖迅速，在第8d進(jìn)入平臺期。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果
　　ADSCs對CD31，CD34以及CD45，CD106表達(dá)很低，同

9、時也可觀察到CD14，CD56和CD105均呈較低表達(dá)，而其對CD49d卻有較強的表達(dá)，CD49d為ADSCs特異性表達(dá)的標(biāo)志物，而造血系統(tǒng)來源細(xì)胞并不表達(dá)此標(biāo)記物。以上均說明實驗中所獲取的是ADSCs。
　　3.成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫組化和AB/PAS染色、天狼猩紅染色結(jié)果
　　免疫組化顯示ADSCs在成軟骨誘導(dǎo)后表達(dá)II型膠原；AB/PAS染色的細(xì)胞分泌有中性及酸性粘多糖成分，其中有較多的軟骨細(xì)胞所特有的酸性糖蛋白基質(zhì)；天

10、狼猩紅染色細(xì)胞爬片在偏振光下可見具有雙折光性的紅色和黃色纖維，也可見少量呈網(wǎng)狀分布的多彩纖維，分別為誘導(dǎo)細(xì)胞分泌出的Ⅰ型和Ⅱ型膠原物質(zhì)。
　　4.裸鼠體內(nèi)構(gòu)建工程化軟骨的結(jié)果
　　裸鼠各個注射點皮膚色澤正常，注射混和凝膠的皮下組織毛細(xì)血管增生，在3w、5w和7w所取裸鼠分別在HE染色下觀察到軟骨細(xì)胞以及部分殘留凝膠。其中實驗組9個點中有4個點出現(xiàn)軟骨，對照組3個點均未發(fā)現(xiàn)軟骨形成。
　　結(jié)論：
　　1.超聲乳化后