靜電紡絲納米纖維支架結(jié)合脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程尿道.pdf

1、組織工程是一門融合了多種學(xué)科知識(shí)的綜合性學(xué)科，是再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分。組織工程的研究方法很多，但其基本策略包括種子細(xì)胞的選擇、支架材料的研制和細(xì)胞與支架的相互作用。
　　 脂肪組織是一種新的成體干細(xì)胞來(lái)源。因?yàn)槿〔姆奖恪⑶秩胄?、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)，脂肪干細(xì)胞已成為組織工程研究中一線種子細(xì)胞。許多研究表明，脂肪組織的生物學(xué)特性與解剖部位有關(guān)。脂肪干細(xì)胞來(lái)源于脂肪組織，其取材部位對(duì)細(xì)胞特性是否也存在這種相關(guān)性，目前尚無(wú)明確結(jié)論。人工合成

2、支架在組織工程研究中的地位越來(lái)越重要。高分子聚合物因其穩(wěn)定而可控的特性應(yīng)用廣泛。聚乳酸質(zhì)脆，降解度高，而聚己內(nèi)酯質(zhì)韌，降解度低，兩者不同比例的復(fù)合物可提供各種性狀的支架。我們利用靜電紡絲技術(shù)制備了兩者的共混物，這種混合物支架由納米級(jí)纖維編織成三維結(jié)構(gòu)，適合模擬細(xì)胞外基質(zhì)。
　　 在本研究中，我們比較了不同解剖部位來(lái)源的脂肪干細(xì)胞特性，結(jié)果顯示兔腹股溝皮下部位是最佳取材部位。同時(shí)研究了聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混支架中兩種成分的混合比例對(duì)

3、其性能的影響，發(fā)現(xiàn)按1/1 比例制備的支架表現(xiàn)出更好的性能。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以1/1 比例的靜電紡絲聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混纖維為支架，通過細(xì)胞在支架上的平滑肌誘導(dǎo)，探索其構(gòu)建組織工程化尿道的可行性。
　　 第一部分不同解剖部位來(lái)源的脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性比較
　　 目的:研究并比較脂肪干細(xì)胞取材的解剖部位對(duì)脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為脂肪干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的選擇策略提供理論基礎(chǔ)。

4、r>　　 方法:5只同齡雌性新西蘭大白兔從出生起在同等環(huán)境中飼養(yǎng)，4月齡時(shí)用于實(shí)驗(yàn)研究，平均體質(zhì)量約2.4kg(2.37～2.42kg)。經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，每只兔在無(wú)菌術(shù)下于3個(gè)部位手術(shù)切取脂肪組織團(tuán)塊，包括腹股溝皮下、頸背部皮下和腹膜后腎周部位。所得脂肪組織經(jīng)常規(guī)分離培養(yǎng)，按來(lái)源部位分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)。三組脂肪干細(xì)胞分別用以下實(shí)驗(yàn)方法比較生物學(xué)行為：(1)倒置相差顯微鏡下形態(tài)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105和CD166以

5、鑒定細(xì)胞；(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線法和活死細(xì)胞染色檢測(cè)細(xì)胞活力；(4)組織化學(xué)染色（堿性磷酸酶染色和油紅染色）、Real-time PCR和Western blot 檢測(cè)成骨、成脂誘導(dǎo)分化能力。
　　 結(jié)果:
　　 (1)細(xì)胞鑒定：①三個(gè)部位的脂肪干細(xì)胞均呈典型間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，肉眼觀察未見明顯差異；②流式檢測(cè)三組細(xì)胞CD105、CD166 標(biāo)志物，其陽(yáng)性率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

6、 (2)增殖能力：①4天時(shí)皮下組織腹股溝和頸背部細(xì)胞數(shù)量均高于腹膜后腎周組，差異有顯著性。兩組皮下組織組之間無(wú)差異。7天時(shí)三組細(xì)胞數(shù)量未檢出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②單因素方差分析比較三組細(xì)胞MTT法測(cè)定的增殖曲線，腹股溝皮下和頸背部皮下組細(xì)胞都較腹膜后腎周組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而兩者之間無(wú)差異。
　　 (3)細(xì)胞活力：①腹股溝組、頸背組、腹膜后組活細(xì)胞數(shù)量逐步遞減，組間兩兩比較均有差異。②三組細(xì)胞經(jīng)活死細(xì)胞染色計(jì)算的活細(xì)胞數(shù)量各組間比較未見統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異。
　　 (4)分化能力：①定量堿性磷酸酶染色示腹股溝皮下來(lái)源脂肪干細(xì)胞成骨分化能力優(yōu)于另兩組，差別均有顯著性。定量油紅染色示三組細(xì)胞成脂分化能力相似。②Real-time PCR檢測(cè)成骨、成脂分化標(biāo)志物均有表達(dá)，各組間比較顯示皮下部位（腹股溝和頸背部）來(lái)源的細(xì)胞表達(dá)量明顯高于腹膜后組，而皮下部位中腹股溝組優(yōu)于頸背部組。③Western blot 檢測(cè)到各標(biāo)志物的蛋白表達(dá)，與Real-time PCR結(jié)果一致。
　

8、　 結(jié)論:
　　 (1)脂肪干細(xì)胞是一種典型的間充質(zhì)干細(xì)胞，其形態(tài)和表型均符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征；
　　 (2)來(lái)源部位對(duì)脂肪干細(xì)胞的增殖、活力和分化能力有影響，皮下來(lái)源的細(xì)胞在各方面優(yōu)于腹膜后來(lái)源，同為皮下組織來(lái)源的腹股溝部位又優(yōu)于頸背部位；
　　 （3）腹股溝皮下部位是脂肪干細(xì)胞現(xiàn)對(duì)較理想的取材部位；
　　 （4）脂肪干細(xì)胞可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，可應(yīng)用于組織工程研究；
　　 （5）脂肪是一

9、種具有高度非均一性的組織，這種非均一性不僅存在于不同個(gè)體之間，也存在于同一個(gè)體不同部位之間。
　　 第二部分靜電紡絲聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混纖維支架與脂肪干細(xì)胞的生物相容性研究
　　 目的:研究利用靜電紡絲技術(shù)制備的聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混纖維的生物相容性，探討不同的重量混合比對(duì)該聚合物支架生物相容性的影響。
　　 方法:利用靜電紡絲技術(shù)將聚乳酸（PLLA）和聚己內(nèi)酯（PCL）的混合物（PLLA/PCL）制備成納米纖維支

10、架，兩種聚合物共混時(shí)的重量比為3/1,2/1,1/1(PLLA/PCL)。對(duì)這三種不同比例的支架進(jìn)行形態(tài)學(xué)、孔隙率、體外降解率的比較；將納米纖維支架作為異物接種到大鼠背部皮下口袋中，以觀察局部炎癥反應(yīng)，評(píng)價(jià)材料的組織相容性；以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，接種到三種比例的支架上，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、粘附、活力和多向分化（成骨分化、成軟骨分化、成脂分化）能力，評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞相容性。
　　 結(jié)果:
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察：（1）纖維直徑：

11、3/1 支架為1.25±0.27μm，2/1 支架為870±45nm，1/1 支架為452±24nm，1/1 支架較3/1，2/1 NFS 差異有非常顯著性；(2）孔隙率：三種比例支架孔隙率分別為78.3±3.4％，78.7±5.1％和82.2±4.8％，三者間未檢出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（3）降解率：根據(jù)降解曲線顯示，PLLA 含量越大，支架體外降解率越高。
　　 2.組織相容性：三種支架移植均導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，急性炎性反應(yīng)過程約2周時(shí)間

12、，4周后炎癥反應(yīng)消失。
　　 3.細(xì)胞相容性：脂肪干細(xì)胞可在支架上粘附、增殖并多向分化，脂肪干細(xì)胞與1/1 支架組裝的復(fù)合體有最好的生物學(xué)行為表現(xiàn)。
　　 結(jié)論:
　　 （1）PLLA和PCL的共混溶液可經(jīng)靜電紡絲技術(shù)制備具有納米結(jié)構(gòu)的纖維支架；
　　 （2）PLLA、PCL 混合的重量比率對(duì)兩者的靜紡共混纖維在形態(tài)、孔隙率、降解率有影響，1/1 比例的材料性能最優(yōu)；
　　 （3）靜紡PLLA/P

13、CL 支架生物相容性好，可作為組織工程候選支架材料。
　　 第三部分尿道組織工程：脂肪干細(xì)胞在靜電紡絲納米纖維支架上的平滑肌分化
　　 目的:研究脂肪干細(xì)胞在靜電紡絲聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混納米纖維支架上的平滑肌分化，探索該支架材料作為尿道組織工程的可行性。
　　 方法:靜電紡絲技術(shù)制備重量比為1：1的聚乳酸/聚己內(nèi)酯共混納米纖維支架。從兔腹股溝皮下分離脂肪干細(xì)胞，接種到支架上組裝成為復(fù)合體。用平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)支

14、架上的脂肪干細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光、細(xì)胞增殖檢測(cè)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白印記和膠原收縮法比較脂肪干細(xì)胞在有無(wú)支架條件下誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞有無(wú)差別。
　　 結(jié)果:誘導(dǎo)6周后，脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞具有平滑肌細(xì)胞形態(tài)，能夠表達(dá)α-actin和MHC 兩種平滑肌標(biāo)志物，胞體中F-actin 含量接近正常平滑肌細(xì)胞。細(xì)胞增殖顯示，誘導(dǎo)3周時(shí)，支架上誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞數(shù)量較無(wú)支架誘導(dǎo)的細(xì)胞無(wú)差別，而在6周時(shí)，兩者有非常顯著性差別?；蜣D(zhuǎn)錄

15、和蛋白表達(dá)均顯示誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞能夠表達(dá)平滑肌特異性基因或蛋白，且支架對(duì)脂肪干細(xì)胞向平滑肌分化無(wú)影響。收縮功能檢測(cè)顯示誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞具有很好的收縮能力。
　　 結(jié)論:
　　 （1）ASCs 可直接在靜電紡絲PLLA/PCL納米纖維支架上誘導(dǎo)分化為具有收縮功能的SMCs；
　　 （2）ASCs與NFS 構(gòu)建的復(fù)合體可用于尿道組織工程研究；
　　 （3）靜電紡絲PLLA/PCL納米纖維可作為平滑肌組織工程候