結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究.pdf

1、背景和目的:結(jié)核分枝桿菌(Mtb)是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最為重要的傳染性病原體之一。結(jié)核病在全球范圍內(nèi)的死灰復(fù)燃及多種耐藥菌株的流行是控制結(jié)核病的重要策略之一。 業(yè)已肯定，結(jié)核結(jié)節(jié)是結(jié)核病最基本、最重要的病理特征。早期結(jié)核結(jié)節(jié)主要由纖維母細(xì)胞分裂、增殖形成的肉芽組成，隨著炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，逐漸被巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的類(lèi)上皮細(xì)胞(EC)、EC融合或核分裂形成的郎罕氏細(xì)胞所替代。 有文獻(xiàn)報(bào)道，Mtb感染宿主細(xì)胞后可引起MAPK、PI3K／A

2、kt和JAK／STAT通路的激活或抑制，并且已有研究證實(shí)PI3K／Akt和MAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)。但上述通路是否參與結(jié)核桿菌感染時(shí)的單核／巨噬細(xì)胞向EC轉(zhuǎn)化過(guò)程，至今未有報(bào)道。 在以往工作基礎(chǔ)上，本研究選用人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株、牛分枝桿菌bovis株和草分枝桿菌phlei株3種菌株分別感染人單核細(xì)胞株THP-1，建立分枝桿菌感染細(xì)胞模型，用Pathscan(R) Phospho-p38 MAP kinase

3、 alpha(Thr180／Tyr182)Sandwich ELISA Kit、Pathscan(R) Phospho-Akt1(Ser473)Sandwich ELISA Kit和Pathscan(R) Phospho-Stat3(Tyr705)Sandwich ELISA Kit檢測(cè)感染后胞內(nèi)p38、Akt1和STAT3的磷酸化水平；采用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)分枝桿菌感染前后單核／巨噬細(xì)胞表面CD的表達(dá)情況，并用各通路特異性阻斷劑進(jìn)行

4、驗(yàn)證；采用磷酸苯二鈉比色法檢測(cè)感染后胞內(nèi)酸性磷酸酶活性的變化。 方法:人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株、牛分枝桿菌bovis株和草分枝桿菌phlei株分別感染THP-1 2h，對(duì)照LATEX BEADS作用30min，終止感染后，分別于0h、0.5h、3h、6h和12h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)感染細(xì)胞中MAPK通路關(guān)鍵分子p38MAPK、P13K／Akt通路關(guān)鍵分子Akt1和JAK／STAT通路關(guān)鍵分子STAT3的磷酸化水平，以O(shè)D450值的

5、變化來(lái)表示。 分別用上述通路特異性阻斷劑SB203580、LY294002和AG490，預(yù)處理THP-1 30min后，分別加入3種菌株，37℃孵育72 h。分別加入抗CD分子的相應(yīng)一抗及二抗，采用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)感染前后CD表達(dá)情況以及各通路阻斷劑處理前后CD變化情況。 人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株、牛分枝桿菌bovis株和草分枝桿菌phlei株分別感染THP-1 2h，對(duì)照LATEX BEADS作用30min，終止

6、感染后，分別于0h、24h、48h、和72h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)感染細(xì)胞中酸性磷酸酶活性的變化，以酶活性單位表示。 結(jié)果:H37Rv株或bovis株感染的THP-1細(xì)胞可出現(xiàn)一過(guò)性p38MAPK磷酸化水平上調(diào)，但P13K／Akt和STAT3磷酸化水平均無(wú)明顯變化。 三株分枝桿菌感染的THP-1細(xì)胞均出現(xiàn)CD14、CD115表達(dá)減弱和CD82、CD138明顯表達(dá)的現(xiàn)象。p38MAPK、PI3K／Akt或JAK／STAT通路被阻

7、斷后，上述三株分枝桿菌感染的THP-1細(xì)胞仍表達(dá)CD14、CD115。JAK／STAT通路被阻斷時(shí)，各分枝桿菌感染的THP-1細(xì)胞仍表達(dá)CD82、CD138。但p38MAPK、PI3K／Akt通路被阻斷時(shí)，H37Rv株和bovis株感染的THP-1細(xì)胞CD82、CD138表達(dá)消失。 THP-1細(xì)胞感染H37Rv株48h后，酸性磷酸酶水平有明顯下降趨勢(shì)。 結(jié)論:結(jié)核分枝桿菌H37Rv株和分枝桿菌bovis株感染后可誘導(dǎo)THP-1細(xì)