抗原靶向不同樹突細胞亞群誘導抗結(jié)核分枝桿菌免疫應答的研究.pdf

1、世界上三分之一的人感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，使得結(jié)核病(tuberculosis，TB)成為世界范圍內(nèi)最嚴重的細菌性傳染疾病之一，導致每年160萬人死亡，嚴重威脅人類的健康和公共衛(wèi)生安全。目前人類唯一使用的抗結(jié)核疫苗：卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)，由牛結(jié)核分枝桿菌經(jīng)多次傳代減毒而來。然而BCG對于成人肺結(jié)核的保護效果很不穩(wěn)定，造成BCG保護力有

2、限的可能原因有：(1)BCG的過度減毒，在減毒傳代過程中丟失了編碼保護性抗原的基因序列，例如缺失基因差異區(qū)域；(2)盡管BCG能夠激發(fā)抗MTB免疫應答，然而MTB隱藏于肉芽腫中，特異性效應T細胞很難與其直接發(fā)生作用；(3)BCG在激發(fā)保護性Th1應答的同時也活化了調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cell，Treg)，消減了效應性T細胞有效的保護作用。
　　 BCG保護率的不穩(wěn)定，加上TB與人類免疫缺陷病毒(Human i

3、mmunodeficiencyvirus,HIV)的共感染，以及結(jié)核桿菌多重耐藥菌株甚至極端耐藥菌株的出現(xiàn)使得TB呈現(xiàn)全球預警狀態(tài)，因此更加理性的設(shè)計新型TB疫苗及尋求更為合理的抗TB免疫策略是亟待解決的研究課題。盡管對于開發(fā)新型TB疫苗已進行了大量的工作，但就目前而言，其中只有少數(shù)能夠與BCG相當或稍優(yōu)于BCG的保護效果。對于樹突細胞(dendritic cell，DC)的分類、功能及其在調(diào)節(jié)免疫應答中重要作用的了解，以及體內(nèi)靶向DC

4、相關(guān)研究工作表現(xiàn)出的較為理想的應用前景，使得體內(nèi)抗原靶向DC成為設(shè)計新型TB疫苗或抗TB免疫策略的新思路。事實上，至目前為止，尚未有關(guān)于體內(nèi)靶向DC，誘導抗TB保護性免疫應答的相關(guān)研究報道。
　　 DC具有相似的細胞形態(tài)，大量分布于淋巴組織的T細胞區(qū)域，高表達MH-C-Ⅱ類分子，具有突出的持續(xù)攝取環(huán)境中抗原分子并加工遞呈給T細胞的潛能。根據(jù)分化過程、表型、成熟機制及專屬職能等的不同，DC被分為不同的亞群。目前對于小鼠DC的分類已

5、較為成熟，雖然人DC亞群不能完全等同于小鼠DC亞群，但是在小鼠和人中均發(fā)現(xiàn)了漿細胞樣DC，血液來源的淋巴組織駐留型DC，外周遷移型DC以及單核細胞來源的炎性DC等亞群，使得以小鼠為模型的體內(nèi)DC靶向研究具有向人類臨床研究過渡的可能。大量研究數(shù)據(jù)顯示不同DC亞群在支配調(diào)節(jié)如CD4+T細胞分化等獲得性細胞免疫應答中的表現(xiàn)各異，因此利用其特異性表面分子的單克隆抗體進行體內(nèi)抗原靶向的策略來直接操控各DC亞群，能夠調(diào)節(jié)、控制免疫應答的方向，是制備

6、預防性/治療性疫苗的理想方式。
　　 目前抗體介導的體內(nèi)DC抗原靶向研究中，多采用化學耦連或利用基因重組技術(shù)將目的抗原插入針對DC表面受體的抗體分子基因組的方法，實現(xiàn)目的抗原靶向DC。雖然多種DC表面受體分子均能傳遞外源信號，啟動T細胞應答，然而很難預測在應對特定病原體感染時，目的抗原靶向哪一種DC亞群/DC表面受體分子能產(chǎn)生最為理想的抗病原體保護性免疫應答。因此對靶向不同DC亞群產(chǎn)生的免疫應答進行比較，對于發(fā)現(xiàn)最適宜的靶向亞群

7、或靶向分子具有指導意義。本研究開發(fā)出一種簡單方便、可選性高的靶向系統(tǒng)：將MTB免疫優(yōu)勢抗原分子與鏈酶親合素(streptavidin,SA)進行融合表達并四聚體化，在SA與生物素(biotin,biot)間高親和力的作用下，四聚體化的SA融合蛋白可與biot標記的DC表面分子單抗可形成復合物。利用這個靈活的模式，在獲得SA融合蛋白后，利用biot標記的針對不同DC亞群表面受體分子的特異單抗，可快速簡便的將目的抗原靶向小鼠和人相應的DC亞

8、群。本研究中使用的靶向抗原來源于早期分泌抗原靶6(Earlier secreted antigentarget6，ESAT-6)蛋自家族(ESX)，這些高度保守、低分子量的MTB保護性抗原由MTBⅦ型分泌系統(tǒng)表達，在小鼠、豚鼠以及不同遺傳背景的人群中表現(xiàn)出較好的免疫原性，在動物模型中表現(xiàn)出保護作用，且這些抗原分子的特異效應性CD4+、CD8+T細胞與MTB感染者體內(nèi)抗MTB保護性應答相關(guān)。本研究中，利用該方便靈活的抗原靶向系統(tǒng)，將MTB

9、 ESX免疫優(yōu)勢抗原靶向不同的DC表面分子，以期篩選出能產(chǎn)生最為理想的抗結(jié)核免疫應答的DC靶點/DC亞群。
　　 1.抗體介導的結(jié)核分枝桿菌ESX抗原體外靶向DC
　　 首先在體外實驗中對這種抗原靶向方法的功能和特異性進行評價：證明經(jīng)biot標記的DC表面分子單抗(針對：CD11b、CD11c、MHC-Ⅱ、DCIR-2或PDCA-1)的導向作用，ESX-SA融合蛋白可高效的結(jié)合在抗原遞呈細胞表面。靶向漿細胞樣DC表面分子

10、PDCA-1或經(jīng)典DC表面分子CD11b、CD11c、MHC-Ⅱ、DCIR-2的ESX抗原分子可有效的被細胞攝取內(nèi)吞。為評價抗原遞呈細胞對靶向的ESX抗原的加工遞呈能力，利用BCG免疫小鼠制備了ESX抗原(TB10.4，ESX-H)特異性MHC-Ⅱ限制性T細胞雜交瘤。試驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)典DC、漿細胞樣DC或巨噬細胞對靶向的ESX抗原通過MHC-Ⅱ類加工機制進行處理，ESX抗原表位與MHC-Ⅱ分子形成復合物，高效遞呈至ESX特異性T細胞雜交瘤或

11、MTB野生株H37Rv感染的小鼠脾臟T細胞。
　　 2.抗體介導的ESX抗原體內(nèi)靶向不同DC亞群誘導抗結(jié)核免疫應答
　　 對ESX-SA融合抗原靶向DC表面受體分子產(chǎn)生的免疫原性進行比較。這些DC受體分子包括MHC-Ⅱ分子，整合素CD11b、CD11c，漿細胞樣DC抗原-1(plasmocytoid dendritic cell antigen-1，PDCA-1/CD317)和C型凝集素受體(C-typelectin r

12、eceptors，CLRs)：甘露糖受體家族的CD205，唾液酸糖蛋白受體家族的CD207(langerin, Clec4K)、CD209(DC-specific ICAM3-Grabbing non-integrin，DC-SIGN)以及唾液酸糖蛋白受體家族DC免疫受體亞家族的DCIR2(Clec4A)。根據(jù)ESX抗原靶向后：(1)體內(nèi)ESX抗原靶向DC并經(jīng)MHC途徑遞呈的效率；(2)誘導ESX抗原特異性Th1、Th2、Th17和Tr

13、eg獲得性免疫應答的效果；(3)交叉激活ESX特異性CD8+T細胞的能力；(4)繼BCG初免后DC靶向免疫策略的潛在加強功效，以期篩選出最適宜進行靶向、能夠誘導理想的抗MTB免疫應答的DC亞群或DC表面受體分子。
　　 體內(nèi)研究顯示該靶向系統(tǒng)具有高度特異性，只有經(jīng)DC表面分子抗體靶向的DC亞群表面才能檢測到ESX的結(jié)合，分選出這些DC進行體外培養(yǎng)能夠有效遞呈靶向的ESX抗原至特異性MHC-Ⅱ限制性T細胞雜交瘤。
　　 E

14、SX-SA與biot標記的DC表面分子單抗形成復合物，輔以多聚肌苷酸-胞苷酸(Poly inosinic：Poly cytidylic acid，PolyⅠ∶C，聚肌胞)作為DC激活因子免疫小鼠，對產(chǎn)生的抗原特異性T細胞應答進行比較。僅一次注射低至1μg(50pmole)劑量的ESX-SA(ESAT-6-SA)，靶向DC表面CD11b、CD11c或CD205可高效誘導ESX特異性Th1、Th17應答，靶向CD207或PDCA-1也能顯著

15、激發(fā)Th1應答，只是程度稍低，而靶向CD209未能誘導抗原特異性的Th1免疫應答。利用biot-SA靶向系統(tǒng)，無論靶向何種DC表面受體分子均不能激發(fā)抗原特異性Th2免疫應答。就所有檢測的CLRs而言，靶向CD205能產(chǎn)生最強的Th1應答。
　　 對不同劑量靶向抗原誘導免疫應答的水平進行分析比較，即使將0.1μg(5pmole)ESX抗原靶向DC表面CD11b分子仍可檢測到抗原特異性Th1、Th17應答。靶向相同劑量的ESX抗原至

16、DC表面分子，F(xiàn)cγR缺失小鼠與野生型小鼠產(chǎn)生的免疫應答水平相當，且在注射biot-Ctrl Ig-ESX-SA復合物的小鼠體內(nèi)不能檢測到特異性獲得性免疫應答，由此說明，本研究中抗體介導的ESX抗原靶向DC，進而為細胞攝取，加工遞呈及激發(fā)免疫應答的過程中未涉及FcR的作用，具有高度靶向特異性。
　　 以減毒活疫苗進行初次免疫，亞單位疫苗進行加強的免疫方法，可能是最為理想有效的抗TB治療性疫苗免疫策略。我們選用ESX家族保護性抗原

17、、亞單位疫苗的熱門候選分子TB10.4來評價繼BCG初免后，TB10.4靶向DC的免疫加強效果。對BCG初免的小鼠，以biot標記單抗將TB10.4-SA靶向DC表面CLRs：CD205、CD207、CD209、DCIR-2或PDCA-1作為加強免疫，可不同程度的增強TB10.4特異性IFN-γ免疫應答；在誘導Th17免疫應答方面，靶向CD205的免疫加強效果最好，其次是CD207和PDCA-1。比較各種免疫條件，發(fā)現(xiàn)只有在BCG初免，