法舒地爾（HA-1077）對人骨髓間充質干細胞向表皮細胞表型分化影響的初步研究.pdf

1、骨髓間充質干細胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)具自我復制及多向分化潛能，能分化為骨、軟骨、脂肪、肌細胞和各種血細胞等。同時，MSCs取材方便，在體外易于分離，培養(yǎng)和擴增，因此得到了很多學者的關注。進一步研究表明<'[3]>，在不同的微環(huán)境下MSCs還可向某些附屬器官分化，如脂肪細胞、格根包爾式細胞、血管內皮細胞和汗腺細胞等。在體外條件下還有人將成纖維細胞培養(yǎng)的上清液和EGF等加入到培養(yǎng)體系中，MSCs出現(xiàn)了表

2、皮細胞表型角蛋白的表達。這些研究都表明，MSCs在創(chuàng)傷修復尤其是皮膚損傷修復方面具有廣闊的前景和越來越重要的意義。 MSCs的分化要經過一系列復雜的信號調控并與靶器官相互作用，信號平衡的改變可能導致分化結果的迥然不同，但其具體機制尚不清楚。小分子GTP酶Rho家族(RhoGTPases)是調節(jié)細胞功能的一類重要蛋白分子，參與彈性纖維形成、細胞凋亡及多條信號通路的調節(jié)；Rho/ROCK(RHO-dependent protein

3、 kinase)信號途徑是諸多調控細胞增殖的酪氨酸激酶受體信號通路的樞紐，與細胞骨架構成、極性生長和細胞周期進程關系密切。現(xiàn)有證據表明，調控ROCK活性對于神經元細胞、T淋巴細胞以及角質細胞的分化相當重要，ROCK的抑制劑還能夠加速MSCs向神經元樣細胞的分化。2003年Raffaella等<'[4]>研究發(fā)現(xiàn)，Rho/ROCK信號途徑是決定向脂肪和肌形成過程中的關鍵分子開關，并認為對于MSCs的分化可能同樣具有意義。在誘導MSCs向表

4、皮細胞分化過程中，本實驗選擇Rho/ROCK信號轉導通路抑制劑HA-1077(fasudil，法舒地爾)，通過對Rho/ROCK信號途徑的干預，利用體外細胞培養(yǎng)、免疫細胞化學、流式細胞儀等技術，從細胞生物學、細胞表型表達等方面來觀測其對人骨髓間充質干細胞(humanmesenchymal stem cells，hMSCs)向表皮細胞分化的影響。 目的 探討在特定條件下法舒地爾(HA-1077)對hMSCs向表皮細胞表型

5、分化的影響。 方法 1、取胎兒股骨骨髓腔抽洗液，F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心法提取、培養(yǎng)并擴增hMSCs，流式細胞儀測定細胞表面CD34、CD44表達。 2、采用兒童新鮮包皮組織帖壁培養(yǎng)纖維細胞并收集上清液。 3、體外誘導MSCs向表皮細胞表型分化的實驗分為4組：①對照組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM)；②誘導組(培養(yǎng)基，采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+10ng/mlEG

6、F)；③HA-1077誘導組1(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+10ng/mlEGF+10μmol/L HA-1077)；④HA-1077誘導組2(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+10ng/mlEGF+30μmol/L HA-1077)。 4、流式細胞儀檢測鑒定分組誘導2天后hMSCs CK5/8表達。 5、免疫細胞化學染色鑒定各組hMSCs誘導4天后CK5/8

7、的表達并觀察細胞形態(tài)變化，具體操作按試劑盒說明書進行。 6、在誘導7天后測定各組細胞CK5/8、CK10/13、CK19表達和PCNA、P．ERK的陽性率及細胞周期變化。 7、采用SPSS13.0軟件對數據進行統(tǒng)計學處理，多個樣本均數比較選用單因素方差分析、兩兩比較選用最小顯著差法。p<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 結果 1、采用Ficoll-Paque密度梯度離心法提取、培養(yǎng)并擴增人胚胎股骨MSCs

8、均一性良好，流式細胞儀檢測結果顯示CD34陽性率約為0.12％，CD44陽性率約為91.53％。 2、分組培養(yǎng)48h后各組細胞形態(tài)無明顯變化，流式細胞儀鑒定顯示①對照組、②誘導組、③HA-1077誘導組、④HA-1077誘導組<,2>CK5/8陽性表達率分別為0.23±0.05％、0.95±0.09％、1.14±0.11％、2.46±0.49％，呈上升趨勢。誘導前后即MSCs①和②③④組差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05，p<0.

9、01，p<0.01)。隨著時間延長，MSCs②③④中角蛋白陽性表達逐漸提高。 3、誘導后4天免疫細胞化學顯示：各誘導組細胞形態(tài)仍無明顯變化，免疫細胞化學染色可見MSCs①無CK5/8的表達，余各組均呈現(xiàn)不同程度的CK5/8的表達，以MSCs③④培養(yǎng)基誘導的表達最多。和第2天流式細胞儀測定結果一致。 4、誘導7天后流式細胞儀測定表明，MSCs①②③④四組中CK5/8、CK10/13、CK19的陽性表達率(見表1)均明顯呈上

10、升趨勢，在三種角蛋白的比較中：HA-1077作用前、后即MSCs②組與③或④組比較差異均顯著(p<0.01，p<0/01)，單純誘導前、后即MSCs①與②組比較均有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。 5、流式細胞儀顯示誘導7天后單純誘導組即MSCs②組與HA-1077作用組即MSCs③中PCNA的陽性表達率均高于(9.78±3.33％，10.72±1.05％；p<0.01，p<0.01)對照組MSCs①(3.31±0.76％)。同時

11、，細胞周期表明在MSCs①②③組中處于G0/G1期的細胞逐漸減少，處于S期的比例上升；其中單純誘導前、后即MSCs①與②組比較(p<0.05)，HA-1077作用前、后即MSCs②組與③組比較(p<0.01)差異顯著。 6、誘導7天后流式細胞術結果顯示HA-1077作用前、后即MSCs②組與③組之間的P-ERK陽性表達率比較差異顯著(p<0.01)。 結論 1、采用密度梯度離心法可得到成份均一、純度高的hMSC