黃鱔性逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的克隆及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本研究克隆獲得了黃鱔wt1、foxl2、dax1和amh基因的全長(zhǎng)序列，并分析了它們?cè)邳S鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織間的表達(dá)差異。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)wt1、foxl2、dax1在不同物種間保守性較高，而amh在不同物種間保守性并不高。18s、ef1α和rpl17為黃鱔性腺發(fā)育研究中穩(wěn)定的內(nèi)參基因，可以對(duì)目的基因進(jìn)行矯正。半定量研究結(jié)果表明，wt1和dax1基因廣泛分布在包括性腺在內(nèi)的多個(gè)組織中，說明這兩個(gè)基因的功能比較復(fù)雜。而在性腺、腦

2、和眼中能檢測(cè)到foxl2的表達(dá)，表明該基因參與了魚類眼部結(jié)構(gòu)的形成和發(fā)育。amh只局限在性腺中表達(dá)，表明該基因?qū)π韵俚陌l(fā)育和分化具有重要作用。實(shí)時(shí)熒光定量和免疫組織化學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，wt1基因在三種性別的性腺中都有表達(dá)，且wt1蛋白主要在精巢的支持細(xì)胞中表達(dá)以及只在卵巢的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，表明該基因不管是對(duì)精母細(xì)胞的生長(zhǎng)以及精子的成熟，還是對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟都起到了一定的作用;在雌性卵巢顆粒細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及未成熟的卵母細(xì)胞中能檢測(cè)到

3、foxl2蛋白的分布，并且在性腺中的表達(dá)量雌性＞間性＞雄性，foxl2蛋白也分布在間性性腺和雄性性腺的精巢間質(zhì)細(xì)胞中，表明卵母細(xì)胞的發(fā)育以及功能的維持需要foxl2的持續(xù)表達(dá)，且它對(duì)雌雄同體魚類的精巢功能的維持也起到重要的作用。相反，amh基因在性腺中的表達(dá)量雄性＞間性＞雌性，表明該基因的上調(diào)能夠啟動(dòng)黃鱔雄性支持細(xì)胞的分化，并且對(duì)黃鱔雄性的發(fā)育和精巢的維持具有一定的作用。dax1不管是在雌性、間性和雄性都有高水平的表達(dá)，表明它與黃鱔卵巢

4、的發(fā)育以及精巢的發(fā)育和維持有關(guān)。此外，這些基因也可以通過直接或間接調(diào)控cyp19a1amRNA的表達(dá)來調(diào)控性腺的發(fā)育。
　　本研究測(cè)定了HPG軸、HPT軸和HPI軸上相關(guān)激素和基因的表達(dá)。血清激素測(cè)定結(jié)果表明，雌二醇(E2)和皮質(zhì)醇激素在黃鱔性腺發(fā)育不同時(shí)期沒有明顯的變化趨勢(shì)，表明E2和皮質(zhì)醇對(duì)性腺發(fā)育的影響可能還受到其受體基因的調(diào)控。但三碘甲狀腺原氨酸(T3)和游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)在雌性和雄性中表達(dá)量很高，但在間性中有

5、顯著下降，表明甲狀腺激素可能參與黃鱔的性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)過程的啟動(dòng)。對(duì)促性腺激素受體基因的研究顯示，fshr和lhr基因在隨著黃鱔性腺的發(fā)育都有先升高后降低，然后再升高的變化趨勢(shì)。lhr在產(chǎn)卵前期（雌性V期）表達(dá)量達(dá)到高峰，而fshr在雄性時(shí)期達(dá)到高峰，結(jié)果表明LH對(duì)誘導(dǎo)黃鱔卵母細(xì)胞的成熟和排卵有關(guān)，且FSH和LH對(duì)調(diào)節(jié)早期精巢的發(fā)育，精子的發(fā)生以及成熟具有重要作用。star基因的表達(dá)模式與fshr類似，表明star基因與黃鱔精巢的早期分

6、化和精子的成熟有關(guān)。另外，star基因的表達(dá)和fshr基因的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性，表明在黃鱔性腺發(fā)育過程中，star基因的表達(dá)可能受到FSH的調(diào)控。
　　在對(duì)黃鱔vtg基因的表達(dá)模式研究中發(fā)現(xiàn)，vtg基因主要在肝臟中表達(dá)，特別是在雌性中，說明黃鱔雌性卵母細(xì)胞發(fā)育過程需要外源性的肝臟合成的卵黃蛋白原。卵巢發(fā)育從第Ⅲ期到第Ⅳ期和Ⅴ期時(shí)，vtg基因在肝臟中的表達(dá)量顯著升高，表明肝臟中卵黃蛋白原基因表達(dá)量的升高與卵母細(xì)胞卵黃的積累和成熟相

7、關(guān)。但隨著黃鱔卵母細(xì)胞的退化和精巢組織的發(fā)育，肝臟中卵黃蛋白原基因表達(dá)量顯著下降，待進(jìn)入雄性時(shí)期時(shí)基本檢測(cè)不到卵黃蛋白原的表達(dá)，表明肝臟卵黃蛋白原合成量的減少有助于卵母細(xì)胞的退化和精巢發(fā)育的激活。另外，本研究還測(cè)定了黃鱔er基因的兩個(gè)亞型，erα和e邛，以及ar和gr基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期肝臟組織和性腺組織中的表達(dá)差異。研究表明，erα在肝臟的表達(dá)量高于erβ，表明erα比erβ在肝臟卵黃蛋白原的生成調(diào)節(jié)中具有更重要的作用。erα在

8、肝臟中的表達(dá)量隨著卵黃的積累以及卵母細(xì)胞的成熟逐漸降低，表明E2對(duì)雌性黃鱔卵黃的積累的作用可能主要是通過erα來介導(dǎo)的，且隨著卵母細(xì)胞的成熟，E2誘導(dǎo)卵黃的積累作用減弱。但隨著卵母細(xì)胞的成熟，vtg的表達(dá)量顯著性升高，說明卵黃的積累除了受到E2的誘導(dǎo)外還受到其它激素的干擾。在性腺中，erα的表達(dá)量隨著卵母細(xì)胞的成熟逐漸升高，說明性腺卵母細(xì)胞的成熟與排卵可能需要一定水平的E2的刺激。當(dāng)性腺發(fā)育進(jìn)入間性時(shí)期，肝臟erα的表達(dá)量有所升高，可能

9、是由于黃鱔卵母細(xì)胞發(fā)育不同步，進(jìn)入間性時(shí)期時(shí)仍需要持續(xù)的卵黃蛋白原的供應(yīng)，而性腺中erα的表達(dá)量顯著降低，表明E2對(duì)性腺作用的減退有助于卵母細(xì)胞的退化和精巢組織的發(fā)育。但雄性性腺中erα也有高水平表達(dá)，表明E2也參與了雄性性腺的發(fā)育和精巢的維持。ar的表達(dá)量在雌性和雄性黃鱔中都是隨著卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞的發(fā)育與成熟表達(dá)量顯著升高，表明ar對(duì)黃鱔雌性性腺和雄性性腺的發(fā)育都起到了一定的作用。gr水平也是隨著性腺的發(fā)育表達(dá)量逐漸升高，特別在雄性