黃鱔抗菌肽hepcidin基因ORF的克隆與原核表達(dá).pdf

1、抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的小分子物質(zhì)，是生物天然免疫反應(yīng)系統(tǒng)的重要成員，在生物體抵抗外界病原感染過程中起著非常重要的作用?？咕姆植际謴V泛，并且對大多數(shù)革蘭氏陰性或陽性菌、真菌、原生動物都有抑制作用，有些抗菌肽還具有抗寄生蟲、病毒和腫瘤的作用。
　　 本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的黃鱔腸道cDNA文庫中獲得的抗菌肽hepcidin基因ORF區(qū)（GenBank登陸號：GU997139）設(shè)計(jì)并合成特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)從黃

2、鱔腸道總RNA中擴(kuò)增出一條約300bp的目的基因片段。將目的基因片段克隆到pMD18-T載體上，序列測定結(jié)果表明與hepcidin基因ORF區(qū)完全一致。序列分析表明：該基因ORF區(qū)長273bp，編碼90個(gè)氨基酸，分子量約10236Da，包括24個(gè)氨基酸的信號肽、40個(gè)氨基酸的前域和26個(gè)氨基酸的成熟肽。結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其屬于β-折疊類抗菌肽，包含有hepcidin類抗菌肽典型的8個(gè)半胱氨酸結(jié)構(gòu)，形成4對二硫鍵。利用氨基酸序列進(jìn)行同源比對，發(fā)

3、現(xiàn)黃鱔抗菌肽hepcidin與多種肉食性魚類的抗菌肽hepcidin同源性較高，其中與大黃魚的同源性最高，為81％。
　　 分別設(shè)計(jì)帶限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的特異性上、下游引物，以pMD18-T-hepcidin陽性克隆質(zhì)粒為模板，亞克隆黃鱔抗菌肽hepcidin基因完整的ORF區(qū)(s-hepcidin)和不含信號肽的hepcidin基因(n-hepcidin)編碼序列，并插入原核表達(dá)載體pET32a(+)，

4、構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(＋)-s-hepcidin和pET32a(+)-n-hepcidin。分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，在37℃，1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定分析，pET32a(＋)-s-hepcidin陽性重組菌沒有表達(dá)出預(yù)期的目的蛋白；而pET32a(+)-n-hepcidin陽性重組菌明顯表達(dá)出目的融合蛋白，大小約為28KDa，與預(yù)期目的融合蛋白分子量大小一致。對pET