MUC1多肽致敏樹突狀細胞誘導CTLs體外殺傷白血病細胞的實驗研究.pdf

1、目的 1．應用GM-CSF、IL-4及CD40L等多種細胞因子從健康志愿者的外周血單個核細胞誘導培養(yǎng)出樹突狀細胞(DC)，并通過形態(tài)學觀察、細胞免疫表型檢測等對DCs進行鑒定。2．以急性單核細胞白血病IJ937細胞株及急性紅白血病K562細胞株為研究對象，應用RT—PCR檢測兩種細胞中MUCl的表達水平。3．DCs體外負載MUCl多肽抗原及白血病細胞凍融抗原，誘導產生特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，觀察CTL。對白血病U937及K5

2、62細胞的特異性殺傷效應。 方法：1．細胞培養(yǎng)：(1)樹突狀細胞培養(yǎng)：采集健康人外周血，分離獲得單個核細胞，加入含rhGM-CSF、rhIL-4及L-谷氨酰胺的小牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，第5d收集懸浮細胞后與rhTNF-α及rhsCD40L共同孵育，第7d收獲細胞。對照組的細胞培養(yǎng)方法同上，但不添加任何細胞因子。(2)淋巴細胞培養(yǎng)：分別收集方法中第一步獲得的非貼壁自體和異體單個核細胞(淋巴細胞)，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含rh

3、IL-2及rhINF-γ)，每2-3d半量換液，培養(yǎng)7d后收獲；(3)U937及K562細胞培養(yǎng)：K562、U937細胞用含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液在5％CO<,2>飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng)，每2-3天換液，細胞鋪滿瓶底時傳代。 2．細胞鑒定及表型分析：(1)樹突狀細胞：在倒置相差顯微鏡下觀察，并應用流式細胞儀檢測細胞表面標記。(2)淋巴細胞：選用CD3、CD4、CD8、CD28及CD56等熒光抗體，流式細胞儀檢

4、測實驗組(DC加異體淋巴細胞共培養(yǎng)組)和對照組(未誘導單個核細胞加異體淋巴細胞)。 3．RT-PCR方法檢測U937及K562細胞中MUC1的表達水平。4．致敏樹突狀細胞誘導CTL對白血病細胞的殺傷作用檢測：實驗組用MUCl多肽抗原(A組)或白血病細胞凍融抗原(B組)沖擊致敏DC后+異體淋巴細胞，誘導特異性CTL；對照組應用未致敏DC(A組)或單核細胞(B組)+異體淋巴細胞；應用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細胞毒作用。

5、 結果：1．樹突狀細胞的形態(tài)學觀察：培養(yǎng)24h后可見貼壁細胞及少量懸浮細胞，培養(yǎng)48h后，細胞數量增多，體積增大，第5天可見細胞呈圓形或不規(guī)則形，偽足樣突起增多。第7天可見細胞表面樹枝狀突起，瑞氏染色下可見細胞體積較大，呈圓或橢圓形，表面有毛刺樣、扁平狀突起，部分可見核仁，同時可見部分破碎細胞漂浮聚集，有少數死亡細胞。2．流式細胞儀表型檢測：(1)經細胞因子誘導培養(yǎng)7天后，CD86、CD40的表達水平均在90％以上， CD80為70％左

6、右，CDla平均為60％左右， CD83平均為40％，而單核細胞特征性標志CD14在5％以下，表明經細胞因子誘導后絕大部分單個核細胞轉變成了DCs。(2)淋巴細胞中活化T細胞免疫表型分析：與對照組相比，經DC激發(fā)的T細胞有上調CD3、CD8、CD28、CD56等膜表面分子的作用。 3．RT-PCR檢測結果：U937和K562細胞中均不同程度的表達MUC1，其中U937細胞中MUCl的表達強于K562細胞。4．致敏DC誘導CTLs細胞毒作

7、用的觀察：無論是實驗組還是對照組，隨著效靶比的增加，細胞的殺傷效應也明顯增加(P<0.05或P<0.01)。在任何一個固定的效靶比例下，實驗組與對照組比較，實驗組的殺傷率均明顯高于對照組(P<0.01)；以上結果表明經抗原致敏的DCs能顯著增強CTLs對U937及K562細胞的殺傷作用。 結論：1．通過聯合應用細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、：rhTNF- α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細胞誘導活化出DC，倒置

8、顯微鏡觀察具有典型樹突狀形態(tài)特征；流式細胞儀檢測表達高水平的共刺激分子，表明經細胞因子誘導得到的DC具有極強的免疫原性。2．通過聯合應用細胞因子rhIL-2、rhINF-γ等誘導培養(yǎng)淋巴細胞，并與DC共培養(yǎng)，流式細胞儀檢測CD3<'+>CD8<'+>、CD3<'+>CD28<'+>、CD3<'+>CD8<'+>CD28<'+>及CD3<'+>CD56<'+>細胞群有所增加。3．U937和K562均不同水平的表達MUCl。4．DC體外負載