柑橘大實蠅蛹期發(fā)育的基因表達(dá)譜分析及海藻糖代謝相關(guān)基因的研究.pdf

1、柑橘大實蠅Bactrocera(Tetradacus) minax(Enderlein)是柑橘類水果的重要害蟲之一，屬雙翅目、實蠅科、果實蠅屬。滯育是昆蟲特定發(fā)育時期發(fā)育停滯，新陳代謝降低以抵御周期性的高溫、低溫、干旱和食物缺乏等不良環(huán)境的一種生理現(xiàn)象，以此來保證昆蟲種群和個體的生存。海藻糖作為昆蟲的血糖，在昆蟲生長發(fā)育和滯育方面起著重要作用。本研究通過對柑橘大實蠅海藻糖合成酶（TPS）、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）和海藻糖酶（Tr

2、e）的分子特性和功能展開了深入的研究，旨在為進(jìn)一步弄清柑橘大實蠅滯育分子機制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.柑橘大實蠅呼吸速率的測定
　　對柑橘大實蠅整個蛹期的呼吸速率進(jìn)行測定，獲得了柑橘大實蠅蛹期呼吸速率曲線，直接證明了柑橘大實蠅蛹滯育的發(fā)生。根據(jù)呼吸速率曲線把柑橘大實蠅蛹期劃分為五個時期，即滯育準(zhǔn)備期（PreD）、滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滯育結(jié)束后發(fā)育期（PD）。此外，對20E注射蛹的呼吸速

3、率進(jìn)行測定，結(jié)果顯示20E可以打破柑橘大實蠅蛹的滯育。
　　2.柑橘大實蠅不同滯育期基因表達(dá)譜分析
　　利用高通量測序技術(shù)對滯育準(zhǔn)備期（PreD）、滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期以及滯育結(jié)束后發(fā)育期（PD）等五個點收集的柑橘大實蠅蛹進(jìn)行表達(dá)譜測序。在十對兩兩比對的表達(dá)譜中，總共有4,808條基因顯著上調(diào)或下調(diào)，這些基因主要與新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和消化系統(tǒng)有關(guān)。利用qPCR技術(shù)對表達(dá)譜的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗證，結(jié)

4、果表明隨機挑選基因的qPCR檢測結(jié)果與柑橘大實蠅數(shù)字基因表達(dá)譜測序結(jié)果呈現(xiàn)高度的相關(guān)性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)=0.9534），說明柑橘大實蠅不同蛹期數(shù)字基因表達(dá)譜測序結(jié)果可信。此外，處于滯育維持期的滯育早（ED）、中（MD）、后（LD）期的樣本在兩兩比較的表達(dá)譜中變化差異不大。
　　3.柑橘大實蠅海藻糖代謝相關(guān)基因克隆及序列分析
　　克隆獲得了柑橘大實蠅5條海藻糖代謝相關(guān)酶基因cDNA全長序列，分別命名為BmTPS、BmTPPB、

5、BmTPPC-1、BmTPPC-2和 BmTre-1。BmTPS開放閱讀框2,445 bp，編碼814個氨基酸殘基。BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2的cDNA開放閱讀框分別為825 bp、822 bp、822 bp，分別編碼274、273、273個氨基酸。BmTre-1的cDNA序列開放閱讀框為1,665 bp，編碼554個氨基酸。預(yù)測BmTPS、BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2和BmTre-1蛋白質(zhì)分子

6、量分別為92.05 kDa、31.27 kDa、30.42 kDa、30.85 kDa和63.78 kDa，等電點分別為6.05、7.10、5.63、5.24和5.15。使用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，BmTPS基因與所有雙翅目昆蟲TPS聚為一類，BmTre-1聚入 Tre-1類別。
　　4.柑橘大實蠅海藻糖代謝相關(guān)基因表達(dá)模式、酶活力及糖含量分析
　　利用RT-qPCR技術(shù)對柑橘大實蠅海藻糖代謝相關(guān)基因在不同發(fā)育階段的的表達(dá)

7、模式進(jìn)行了解析。BmTPS和BmTre-1的表達(dá)模式呈相反的趨勢，BmTre-1在整個蛹期表達(dá)量較低，而BmTPS在整個蛹期表達(dá)量較高。此外BmTPPB、BmTPPC-1和BmTPPC-2基因三者之間的表達(dá)模式有細(xì)微的差別。
　　對海藻糖合成酶（TPS）、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）和海藻糖酶（Tre）這三種海藻糖代謝相關(guān)酶在整個蛹期階段的酶活力進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）呈現(xiàn)出

8、相同的趨勢，第60-120天的階段維持高峰，而Tre酶活力卻在60-120天時下降到最低。
　　對柑橘大實蠅整個發(fā)育階段海藻糖和葡萄糖含量進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，在柑橘大實蠅整個蛹期，其海藻糖含量都維持較高的水平，且波動不大。而葡萄糖含量則是從幼蟲開始至整個蛹期均較低。
　　對柑橘大實蠅1日蛹注射20E后，海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）在化蛹第30天時相較于對照組酶活力顯著上升，而海藻糖酶（Tre）在

9、化蛹第30天和第60天時酶活力相較于對照組則顯著下降。此外注射20E后，海藻糖含量和葡萄糖含量在30日蛹時均顯著下降。
　　5.柑橘大實蠅RNA干擾技術(shù)的初步探究
　　為了建立柑橘大實蠅RNA干擾體系，本研究將dsBmTPS注射到柑橘大實蠅三齡幼蟲。結(jié)果表明，注射2.0或2.5μg dsBmTPS導(dǎo)致很高的沉默效率，其中注射2.0μg dsBmTPS作用效果最好，可以持續(xù)干擾72 h。BmTPS基因的成功干擾也導(dǎo)致了 BmT