過表達(dá)NDRG2基因促進(jìn)人髓核細(xì)胞衰老的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　研究表明椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是臨床上引起腰腿痛以及脊柱生物力學(xué)改變及功能異常的根本因素。目前IDD的主要治療方法為保守治療和IDD末期手術(shù)摘除椎間盤，或行椎體間融合以改善臨床癥狀，但無法逆轉(zhuǎn)椎間盤退行性變的進(jìn)程。椎間盤退行性變的基因治療的研究在近幾年才逐漸興起，但基因治療因其潛在的長(zhǎng)期療效而迅速發(fā)展。髓核細(xì)胞衰老時(shí)蛋白多糖和水分大量丟失，纖維組織增生

2、、纖維環(huán)剝脫、椎體間隙狹窄和椎間盤生物力學(xué)改變。人源NDRG2近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)降低的新基因，隨著對(duì)其功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)NDRG2不僅參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而且也參與了多種細(xì)胞的增殖、分化的調(diào)控。因此，我們推測(cè)髓核細(xì)胞增殖、衰老的調(diào)控可能有NDRG2的參與，可能通過某種分子機(jī)制或通路在椎間盤退行性變中起到重要作用。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒在髓核細(xì)胞系過表達(dá)NDRG2，觀察其對(duì)人髓核細(xì)胞衰老的影響，

3、進(jìn)而探討NDRG2在椎間盤退變中的作用。
　　方法:
　　1.人髓核細(xì)胞（NP cells）的培養(yǎng)；
　　2.利用慢病毒來構(gòu)建過表達(dá)NDRG2的載體，并感染人髓核細(xì)胞；
　　3.Real-time PCR檢測(cè)髓核細(xì)胞中NDRG2的mRNA表達(dá)
　　4.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）檢測(cè)過表達(dá)NDRG2后人髓核細(xì)胞中表達(dá)NDRG2蛋白的情況；
　　5.利用腺病毒載體外源性過表達(dá)P53對(duì)NDRG2蛋白表達(dá)水平的影響

4、，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）檢測(cè)過表達(dá)P53后人髓核細(xì)胞中NDRG2蛋白的表達(dá)情況；
　　6.MTT檢測(cè)髓核細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析過表達(dá)NDRG2髓核細(xì)胞的增殖情況；
　　7.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)定分析過表達(dá)NDRG2后的周期變化；
　　8.SA-β-gal染色檢測(cè)過表達(dá)NDRG2后髓核細(xì)胞的衰老變化情況；
　　結(jié)果:
　　1.在熒光倒置顯微鏡下觀察過表達(dá)NDRG2慢病毒感染48h后成功感染的細(xì)胞熒光為紅色，感染效率在9

5、5％以上；
　　2.Real-time PCR檢測(cè)三組細(xì)胞，Lenti-NDRG2組髓核細(xì)胞較其他兩組NDRG2的mRNA的表達(dá)均明顯增加（P<0.05）；
　　3.感染72h后Western blot檢測(cè)示NDRG2表達(dá)明顯升高；
　　4.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)P53基因后NDRG2蛋白的表達(dá)隨著P53的升高而增加；
　　5.過表達(dá)NDRG2組SA-β-gal染色陽性率較陰性對(duì)照組及正常組顯著增高；
　　

6、6.MTT檢測(cè)髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線分析過表達(dá)NDRG2后髓核細(xì)胞的增殖速度較陰性對(duì)照組及正常組降低；
　　7.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定過表達(dá)NDRG2組髓核細(xì)胞G0/G1期百分比較陰性對(duì)照組及正常組顯著增高，S期降低；
　　8.SA-β-gal染色檢測(cè)過表達(dá)NDRG2組染色陽性率較陰性對(duì)照組及正常組顯著增高；
　　結(jié)論:
　　通過實(shí)驗(yàn)我們可以看到過表達(dá)NDRG2后髓核細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖受到抑制，衰老染色率增高。同時(shí)