人退變髓核細(xì)胞老化信號(hào)通路的體外研究.pdf

1、目的:探索人退變髓核細(xì)胞復(fù)制性老化和應(yīng)激誘導(dǎo)過早老化的信號(hào)通路。
　　方法:
　　1、體外培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞系(Scien Cell4800)。連續(xù)性1∶2傳代、培養(yǎng)（理論上可傳至P15代），誘導(dǎo)髓核細(xì)胞復(fù)制性老化。
　　2、取P1代髓核細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于六孔板，按雙氧水濃度(50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L)和作用時(shí)間(30min、1h、2h)分組，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過早老化。

2、r>　　3、分別對步驟1中的各代細(xì)胞及步驟2中的各組細(xì)胞行顯微鏡觀察髓核細(xì)胞形態(tài)、SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)細(xì)胞老化率、PI染色流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞比例、Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀定量細(xì)胞凋亡率，制備兩組髓核細(xì)胞老化模型。（注:因目前尚無髓核細(xì)胞老化模型的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究中擬定老化率≥80％、G1期細(xì)胞≥80％、凋亡率≤10％的造模組為合格的髓核細(xì)胞老化模型。）
　　4、取P1代髓核細(xì)胞（老化陰性對照組）、

3、復(fù)制性老化模型、應(yīng)激誘導(dǎo)的過早老化模型3組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測3組細(xì)胞p53、p21、p16、pRb的表達(dá)含量。
　　結(jié)果:
　　1、在誘導(dǎo)髓核細(xì)胞復(fù)制性老化過程中，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，髓核細(xì)胞形態(tài)逐漸由類圓形、星形、短梭形向長梭形、不規(guī)則形等轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積逐漸增大、胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率均逐漸增加，傳至P12代時(shí)三者比例分

4、別為82.1％、84.7％、9.8％，差異與正常P1代髓核細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過早老化過程中，隨著雙氧水濃度的增加、作用時(shí)間的延長，細(xì)胞形態(tài)逐漸由類圓形向長梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積增加、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率均逐漸增大，且100μmol／L雙氧水作用P1代髓核細(xì)胞2h后三者比例分別為82.3％、83.6％、8.6％

5、，差異與正常P1代髓核細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在復(fù)制性老化模型中，p53、p21、p16、pRb的表達(dá)量較對照組均有所增加，但p53、p21、pRb表達(dá)量較p16增加明顯，差異較對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，p16的表達(dá)量較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在應(yīng)激誘導(dǎo)的過早老化模型中，p53、p21、p16、pRb的表達(dá)量較對照組均有所增加，但p16、pRb表達(dá)量較p5

6、3、p21增加明顯，差異較對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，p53、p21的表達(dá)量較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過連續(xù)性傳代培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞系(Scien Cell4800)，成功建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化模型（P12代髓核細(xì)胞）;
　　2、通過100μmol/L雙氧水作用于P1代髓核細(xì)胞2h，成功建立應(yīng)激誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞過早老化模型;
　　3、在髓核細(xì)胞復(fù)制性老化中，老化信號(hào)通