人腦膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡與PTEN基因表達的關(guān)系研究.pdf

1、目的：膠質(zhì)瘤是惡性腫瘤中最難治的疾病之一，雖然采用了手術(shù)、放療、化療等綜合治療措施，患者的五年生存率仍然很低。細胞原癌基因的激活或抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移與基因的異常有著密切的關(guān)系，當(dāng)前的研究已證實，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多步驟演變的復(fù)雜過程，因此，膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種基因異常疾病。 PTEN作為新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因。本研究旨在探討抑癌基因

2、PTEN在人腦膠質(zhì)瘤組織中的基因和蛋白表達，并研究其表達與腫瘤惡性程度分級間的相關(guān)性，結(jié)合人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖凋亡情況，分析人腦膠質(zhì)瘤中PTEN基因的表達對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響及二者之間的相關(guān)性，以進一步明確PTEN基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的意義，為進一步體內(nèi)體外實驗以及腫瘤的防治提供理論依據(jù)。 方法：選取50例經(jīng)手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本，按WHO分級情況，分為高分化組與低分化組，以10例正常腦組織標(biāo)本為對照組。采用RT-PCR

3、方法，在轉(zhuǎn)錄水平，分析PTEN基因5、8、9三個外顯子水平mRNA的表達缺失情況。應(yīng)用免疫組化及WesternBlot方法檢測PTEN蛋白在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達情況，比較膠質(zhì)瘤與正常腦組織中PTEN表達的差異，分析PTEN蛋白表達與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系。應(yīng)用流式細胞術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織的增殖指數(shù)(PI)、S期細胞比率(SPF)、DNA倍性和凋亡指數(shù)(AI)以評價腫瘤細胞的增殖和凋亡

4、，分析膠質(zhì)瘤的PI、SPF、DNA倍性、AI與腫瘤病理級別的關(guān)系，以評價PTEN表達水平對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響及二者的相關(guān)性。 結(jié)果50例膠質(zhì)細胞瘤中，外顯子1-8失表達例數(shù)為27例，表達例數(shù)為23例；外顯子1-9失表達例數(shù)為28例，表達例數(shù)22例；外顯子5-8失表達例數(shù)為27例，表達例數(shù)為23例；外顯子5-9失表達例數(shù)為26例，表達例數(shù)24例；在正常腦組織中無一例失表達。腦膠質(zhì)瘤不同基因片段與正常腦組織中mRNA的失表達情況存

5、在統(tǒng)計學(xué)意義；膠質(zhì)瘤不同基因片段間mRNA的表達情況統(tǒng)計學(xué)分析未見明顯差異，且與患者性別、年齡無關(guān)；但在不同臨床分期的腦膠質(zhì)瘤組織中，高分化組與低分化組腫瘤基因片段的PTENmRNA表達水平存在明顯差異，隨膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，其失表達水平相應(yīng)升高。 免疫組化結(jié)果顯示：各級別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織PTEN表達陽性細胞率有統(tǒng)計學(xué)意義，且PTEN蛋白隨膠質(zhì)瘤惡性分級的增高其表達減少；高分化組腫瘤和低分化組腫瘤間PTEN表達陽性率有統(tǒng)計

6、學(xué)意義；Ⅱ級與Ⅲ級、Ⅳ級腫瘤間PTEN表達陽性率比較均有統(tǒng)計學(xué)意義；而Ⅲ級與Ⅳ級腫瘤之間PTEN表達陽性率比較沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異。 對50例膠質(zhì)瘤，10例正常腦組織共計60例樣本行PTEN蛋白濃度測定，得樣本的總蛋白濃度為2.89±0.76ug/ul，符合Westernblot測定的要求。Westernblot結(jié)果顯示在分子量45KD左右可以得到PTEN的雜交信號。在正常腦組織中PTEN的表達水平較高，隨膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，P

7、TEN的蛋白表達水平相應(yīng)降低，Ⅳ級膠質(zhì)瘤中，PTEN表達水平最低；正常腦組織、不同級別的膠質(zhì)瘤組織中均有45KD的雜交信號表達，而且各種組織之間的表達水平?jīng)]有明顯差異。 對膠質(zhì)瘤樣本的流式細胞分析結(jié)果顯示：50例膠質(zhì)瘤的PI為9.32﹪±4.41﹪，SPF為2.79﹪±2.43﹪。高惡性腫瘤(Ⅲ、Ⅳ級)的PI(13.40﹪±5.91﹪)顯著高于Ⅰ級(8.62﹪±3.17﹪)，SPF雖然也增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。50例膠質(zhì)瘤中二

8、倍體34例，異倍體16例，未見四倍體，總的異倍體率為32.0﹪。其中低分化組(Ⅲ級、Ⅳ級)膠質(zhì)瘤的異倍體率為44.1﹪，高分化組膠質(zhì)瘤為6.3﹪。全部膠質(zhì)瘤的AI平均為7.88﹪±3.76﹪，Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤的AI(13.40﹪±5.91﹪)亦顯著高于Ⅱ級(9.08﹪±4.87﹪)，Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤間的AI、PI、SPF差異無統(tǒng)計學(xué)意義；AI與PI、SPF存在弱的正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論PTEN基因的突變將導(dǎo)致其編碼蛋白的功能異常，但是并

9、不是所有的基因表達產(chǎn)物的異常與基因突變有關(guān)，基因在轉(zhuǎn)錄水平的異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中同樣起著重要的作用。人腦膠質(zhì)瘤中PTEN的表達水平隨膠質(zhì)瘤級別增高而降低，Ⅱ級與Ⅳ級腫瘤PTEN的表達率分別為83.3﹪和33.3﹪，PTEN陽性表達水平可以用來對膠質(zhì)瘤的惡性程度進行判斷。隨著膠質(zhì)瘤病理級別升高腫瘤細胞的增殖活性亦隨之增高，膠質(zhì)瘤的PI可反映其病理級別，而與組織亞型無關(guān)；PI和SPF都是反映細胞增殖活性的客觀指標(biāo)，PI可能較SPF能