HEV豬源株ORF2 C端抗原編碼片段的克隆表達(dá)及其應(yīng)用.pdf

1、以RT-nPCR擴(kuò)增戊型肝炎病毒豬源株swCH25 ORF2基因片斷，并將其插入到pMD18-T simple載體中，構(gòu)建克隆載體pMD-ORF2?？寺〉幕蚱伍L(zhǎng)916bp，編碼305個(gè)氨基酸。與不同基因型部分代表株氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與基因型Ⅳ的同源性最高，為98.0％-98.7％；與基因型Ⅳ的同源性最低，為90.8％；與基因型Ⅰ和Ⅲ同源性分別為92.5-92.8％和95.1-95.7％。用DNAStar Protean分析，s

2、wCH25株ORF2C端片斷與其它株相應(yīng)片斷抗原性預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。 對(duì)克隆載體pMD-ORF2進(jìn)行雙酶切，將得到的926bp片段以正確的閱讀框架定向克隆于pET-32a(十)中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21中，在37℃1.0 mM IPTG誘導(dǎo)下該片段獲得良好表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其表達(dá)的融合蛋白約為55.9kD，與預(yù)期值一致。經(jīng)Ni<'2+>親和層析柱純化后，得到單一的目的蛋白條帶。免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)顯示，該重組蛋白

3、可被豬或人HE陽性血清識(shí)別，表明該重組蛋白具備HEV天然毒株抗原性，且與人HEV存在抗體交叉反應(yīng)性。重組蛋白尿素洗滌上清作SDS-PAGE和Westernblot，均顯示表達(dá)的蛋白在體外可形成二聚體和多聚體。 以HEV中國(guó)豬源株ORF2(367-67laa)基因工程表達(dá)蛋白p3050RF2作為包被抗原，以豬HEV陽性血清作為第一抗體，以HRP標(biāo)記的SPA(HRP-SPA)代替酶標(biāo)抗體作間接ELISA來檢測(cè)豬血清中的HEVIgG。

4、方陣滴定試驗(yàn)確定，p3050RF2的最佳包被濃度約為62ng／孔，豬血清的最佳稀釋度為1：10，HRP-SPA代替酶標(biāo)二抗其工作濃度為1：10000，將建立的ELISA方法命名為p3050RF2 ELISA。隨機(jī)選取91份豬血清，分別用p3050RF2ELISA和HEV總抗體檢測(cè)試劑盒(北京萬泰)兩種方法檢測(cè)HEV，結(jié)果表明p3050RF2 ELISA檢出IgG74份陽性(陽性率為81.32％)，萬泰試劑盒檢出84份IgM及IgG陽性(

5、陽性率為92.31％)，兩種方法的符合率為84.62％(77／91)。用p3050RF2 ELISA檢測(cè)采自江蘇、山東和河南三省的820份豬血清樣本中的HEV IgG抗體，調(diào)查這些地區(qū)豬HEV的感染狀況。結(jié)果表明，江蘇地區(qū)陽性率54.53％(343／629)，山東地區(qū)陽性率46.05％(70／152)，河南地區(qū)陽性率66.67％(26／39)，總陽性率53.54％(439／820)。結(jié)果提示在中國(guó)江蘇、河南和山東地區(qū)普遍存在豬感染HEV