Intermedin對大鼠腎小管上皮細胞缺氧復(fù)氧損傷保護作用及機制的研究.pdf

1、垂體中葉素（Intermedin，IMD）是2004年新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性小分子多肽，屬降鈣素基因相關(guān)肽（calcitoningenerelatedpeptide,CGRP）超家族成員，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究旨在對IMD在大鼠腎小管上皮細胞缺氧復(fù)氧損傷（hypoxia/reoxygenation，H/R）中的保護作用及其機制進行探討。分為以下兩個部分：
　　第一部分IMD通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulums

2、tress，ERS）誘導(dǎo)的細胞凋亡從而發(fā)揮對大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E缺氧復(fù)氧損傷的保護作用
　　實驗一缺氧復(fù)氧損傷可誘導(dǎo)NRK-52E細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生
　　目的：在大鼠近端腎小管上皮細胞NRK-52EH/R模型中檢測ERS經(jīng)典分子的表達，探討ERS在腎臟IRI中的作用；
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)腎小管上皮細胞NRK-52E，隨機分為對照組（control）、缺氧復(fù)氧組（H/R）、衣霉素組（TM）；缺氧1h，復(fù)氧2

3、h制作細胞H/R模型。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，Dapoxyl熒光染料染色檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，realtime-PCR法和Westernblotting法檢測ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspaes12mRNA及蛋白表達。
　　結(jié)果：H/R⑴處理可以導(dǎo)致腎小管上皮細胞NRK-52E凋亡，與正常對照組相比，H/R組和TM組細胞凋亡率顯著增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。⑵Dapoxyl染色結(jié)果可見對照組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分

4、布在核周，無空泡出現(xiàn)。H/R可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)受損，Dapoxyl染料濃集，熒光強度增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒感增強，熒光顆粒分布不均、濃集，并有空泡形成，其結(jié)果與TM組相同，說明H/R可以引起ERS。Realtime⑶-PCR及Westernblotting結(jié)果證實，與對照組相比，H/R可導(dǎo)致ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspase12mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào)（P<0.01），H/R組與TM組無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：在大鼠

5、腎小管上皮細胞NRK-52EH/R后，細胞凋亡率升高；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光染料濃集、顆粒感增強；ERS相關(guān)分子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA及蛋白表達均上調(diào)，提示H/R損傷過程中存在ERS凋亡途徑的活化。因此，減少過度的ERS有可能是成為腎臟IRI防治的新靶點。
　　實驗二IMD通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡減輕腎小管上皮細胞NRK-52E缺氧復(fù)氧損傷
　　目的：利用穩(wěn)定表達IMD的NRK-52E細胞進行缺氧復(fù)氧

6、實驗，觀察IMD對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，探討其細胞保護的分子機制。
　　方法：腎小管上皮細胞NRK-52E，隨機分為對照組（control）、缺氧復(fù)氧組（H/R）、空質(zhì)粒組（H/R+pIRES2）、IMD組（H/R+IMD）。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，Dapoxyl熒光染料染色檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)，realtime-PCR法和Westernblotting法檢測ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspaes12mRNA及蛋白表達。

7、r>　　結(jié)果：IMD⑴轉(zhuǎn)染可顯著降低NRK-52E細胞凋亡率，與H/R組相比，細胞凋亡率降低12％（P<0.05）；而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與H/R組之間差異無顯著性。⑵Dapoxyl染色可見，IMD轉(zhuǎn)染可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)受損。Realtime⑶-PCR及Westernblotting結(jié)果證實，與H/R組相比，IMD組ERS經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA和蛋白表達均明顯下降（P<0.01），H/R組與轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組間無統(tǒng)計學(xué)

8、差異。
　　結(jié)論：IMD可以通過下調(diào)大鼠腎小管上皮細胞H/R后GRP78、CHOP、Caspase-12的表達，抑制ERS及隨后的凋亡信號通路，從而減少腎小管上皮細胞凋亡，減輕腎臟IRI。
　　第二部分IMD對缺氧復(fù)氧后大鼠腎小管上皮細胞增殖作用的影響及其信號通路研究
　　目的：在大鼠近端腎小管上皮細胞NRK-52EH/R模型中研究IMD對H/R后細胞增殖、細胞周期的影響以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白表達的變化，闡明IMD

9、促進腎小管上皮細胞修復(fù)及再生的機制及相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法：腎小管上皮細胞NRK-52E，隨機分為對照組（control），模型組：缺氧/復(fù)氧組（H/R組）、空質(zhì)粒組（H/R+pIRES2）、IMD質(zhì)粒組（H/R+IMD）、IMD質(zhì)粒+PD98059組（H/R+IMD+PD）、IMD質(zhì)粒+anisomycin組（H/R+IMD+anisomycin）。MTT法檢測細胞增殖，分光光度法檢測培養(yǎng)基上清LDH含量，流式細胞術(shù)檢

10、測細胞周期，realtime-PCR法和Westernblotting法檢測cyclinD1、cyclinEmRNA及蛋白表達，熒光素酶活性測定檢測cyclinD1啟動子活性，電泳遷移率實驗（EMSA）測定AP-1位點的DNA結(jié)合活性，間接免疫熒光染色檢測cyclinD1的亞細胞定位。
　　結(jié)果：⑴與對照組相比，H/R組培養(yǎng)基中LDH含量顯著上升，與對照組相比升高了106%。而IMD可顯著降低培養(yǎng)基中LDH含量，與H/R組及空質(zhì)粒

11、組相比分別降低了33.85%、33.46%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；H/R組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（H/R+pIRES2）組無統(tǒng)計學(xué)差別。⑵MTT結(jié)果顯示，H/R組NRK-52E細胞存活率較對照組明顯下降，而IMD轉(zhuǎn)染后細胞存活率提高（80.22±4.42%vs.59.77±9.63%,P<0.05），差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；H/R組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（H/R+pIRES2）組無統(tǒng)計學(xué)差別。H/R⑶可使NRK-52E細胞p-ERK、

12、p-JNK及p-P38活性水平增加，而IMD而進一步增加p-ERK的水平，下調(diào)p-JNK、p-P38的表達。⑷給予ERK抑制劑（PD098059）及JNK、p38通路誘導(dǎo)劑（anisomycin）后，各檢測指標的變化如下：①PD98059抑制了ERK活性而減弱了IMD通過上調(diào)ERK表達對H/R后NRK-52E細胞增殖促進作用，同時培養(yǎng)液中LDH含量也較轉(zhuǎn)染組增加；而anisomycin由于活化了JNK、p38活性，從而也從一定程度上減弱

13、了IMD通過下調(diào)JNK、p38表達對H/R的NRK-52E細胞增殖促進作用及損傷保護作用。②細胞周期結(jié)果顯示，與對照組相比，H/R組細胞G0/G1期比例增加，S期細胞比例降低（P<0.05），說明H/R狀態(tài)下NRK-52E細胞增殖受到抑制。與H/R比較，IMD組均表現(xiàn)為G0/G1期細胞比例顯著降低，而S及G2期細胞比例增加（P<0.05），說明IMD可使細胞越過G0/G1期，具有促進NRK-52E細胞增殖的作用。分別在NRK-52E中加

14、入PD098059（ERK抑制劑）、anisomycin（JNK、p38誘導(dǎo)劑）后，PD098059、anisomycin可在一定程度上對抗這種作用。③realtime-PCR及Westernblotting結(jié)果顯示H/R可增加cyclinD1、cyclinE的表達，這可能是一種損傷后啟動修復(fù)的代償機制，而IMD可進一步上調(diào)cyclinD1、cyclinE的表達，與對照組及H/R組相比具有顯著性差異（P<0.05）；PD098059、a

15、nisomycin可在一定程度上對抗這一上調(diào)作用。cyclinDl④熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示，與對照組相比，H/R組細胞的cyclinD1啟動子活性增加，而IMD可進一步上調(diào)cyclinD1啟動子活性（與對照組相比，P＜0.05；與H/R組相比，P＜0.05）。PD098059（ERK抑制劑）、anisomycin（JNK、p38誘導(dǎo)劑）可在一定程度上對抗這一上調(diào)作用。提示IMD通過調(diào)控cyclinD1啟動子的表達從而調(diào)控其表達。⑤

16、EMSA結(jié)果顯示，IMD可增加AP-1位點的結(jié)合活性顯著上調(diào)，PD098059（ERK抑制劑）、anisomycin（JNK、p38誘導(dǎo)劑）可在一定程度上對抗這一上調(diào)作用。⑥免疫熒光檢測結(jié)果可見，cyclinD1呈紅色熒光，在NRK-52E細胞內(nèi)主要表達在細胞核中，DAPI呈現(xiàn)藍色熒光，pIRES2-EGFP/IMD攜帶EGFP報告基因，呈現(xiàn)綠色熒光。
　　結(jié)論：在腎小管上皮細胞H/R模型中，IMD可以通過上調(diào)cyclinD1啟動