PPARα激動劑非諾貝特對自發(fā)性高血壓大鼠心肌重構(gòu)干預(yù)的實驗研究.pdf

1、心肌重構(gòu)是指在心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中膠原纖維過量積聚、膠原含量顯著升高或膠原成分發(fā)生改變。心肌細(xì)胞外基質(zhì)( extracellularmatrix，ECM)主要由纖維膠原網(wǎng)，基底膜，蛋白多糖和葡糖胺聚糖組成，還包括眾多的生物活性因子，其中膠原占85﹪，主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原。ECM的降解主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)調(diào)節(jié)，而MMPs降解膠原的活性受內(nèi)源性金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)的影響

2、，MMPs-TIMPs的平衡對維持膠原的正常代謝有重要作用。簡言之，高血壓心肌重構(gòu)的發(fā)生是一個由眾多生物活性因子參與并共同調(diào)節(jié)的過程，是膠原生成大于降解的結(jié)果。因此，抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原的合成并促進(jìn)其降解是預(yù)防與逆轉(zhuǎn)高血壓心肌重構(gòu)，改善心功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。過氧化物酶體增殖物激活型受體(PPARs)是1990年發(fā)現(xiàn)的核激素受體超家族的新成員，包括PPARα、PPARβ和PPAγ三個成員。其中PPARα主要表達(dá)在肝臟和腎臟組織中，參與脂肪酸

3、的分解代謝。貝特類調(diào)脂藥(fenofibrate、bezafibrate等)是PPARα的合成配體即激動劑。據(jù)報道，活化的PPARα可以減輕壓力負(fù)荷過重引起的左室肥厚和心肌纖維化，但其中仍有許多問題尚未明了：(1)PPARα激動劑非諾貝特如何干預(yù)高血壓心肌重構(gòu)；(2)PPARα調(diào)控心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的機制。以上問題是構(gòu)成本課題的設(shè)計思路和研究目的。對上述問題進(jìn)行深入研究，不僅有助于闡明高血壓心肌重構(gòu)的分子生物學(xué)機制，而且可以為PPARα

4、激動劑擴(kuò)大新的應(yīng)用領(lǐng)域，為藥物干預(yù)心肌重構(gòu)，從而逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)及由心肌重構(gòu)向心力衰竭的轉(zhuǎn)化提供新思路。 目的: 1．觀察非諾貝特對自發(fā)性高血壓大鼠心肌重構(gòu)的干預(yù)作用。 2．觀察非諾貝特對自發(fā)性高血壓大鼠心肌重構(gòu)中PPARα、C-Fos、C-Jun、TIMP-1、Collagen Ⅰ等基因表達(dá)及對C-Fos/C-Jun異二聚體形成的影響以探討PPARα激動劑在高血壓心肌重構(gòu)中的調(diào)控機制。 方法: 八周

5、齡雄性SHR大鼠24只，隨機分為陽性對照組即SHR組(n=10只)和非諾貝特組(n=14只)，同周齡Wistar京都(WKY)大鼠10只作正常對照組即WKY組(n=10只)。非諾貝特組給予非諾貝特(力平之)60mg/kg.d<'-1>灌胃8周，WKY組和SHR組等量生理鹽水灌胃。實驗過程中，進(jìn)行以下檢測：(1)每周測量體重1次，每兩周檢測尾動脈血壓1次。(2)分別于實驗開始前、實驗?zāi)┻M(jìn)行超聲心動圖檢查，以測量室間隔、左室后壁厚度等指標(biāo)。

6、(3)于實驗?zāi)┮孕膶?dǎo)管法進(jìn)行血流動力學(xué)測定。(4)處死動物后，稱取左室重量(LVM)，計算左室重量／體重(LVM/BW)。(5)心肌組織超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)檢查。(6)應(yīng)用Masson染色進(jìn)行心肌組織間質(zhì)膠原定量。(7)免疫組織化學(xué)檢測C-Fos及C-Jun表達(dá)。(8)實時定量RT-PCR法檢測PPARα，C-Jun，C-Fos，MMP-9，TIMP-1，Collagen Ⅰ，CollagenⅢmRNA的表達(dá)。(9)免疫共沉淀一免疫印跡(C

7、o-IP-Western blot)檢測C-Fos/C．Jull異二聚體的形成。 結(jié)果: 1．各組大鼠血壓水平： 實驗整個過程，與同周齡WKY組相比，SHR組、非諾貝特組血壓明顯升高(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組血壓未見明顯改變(P>0.05)。 2.各組大鼠體重及左室相對質(zhì)量(LVM/BW)： 實驗整個過程，與同周齡WKY大鼠相比，SHR組、非諾貝特組體重明顯下降(P<0.01)；

8、與SHR組相比，非諾貝特組體重未見明顯改變(P>0.05)。 實驗?zāi)?，與WKY組相比，SHR組LVM/BW明顯升高(P<0.01)：與SHR組相比，非諾貝特組LVM/BW明顯下降(P<0.01)。 3.超聲心動圖監(jiān)測： 常規(guī)超聲心動圖指標(biāo)：實驗前，與WKY組相比，SHR組、非諾貝特組IVSTd、LVPWTd及RWT均明顯增加(P均<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組上述指標(biāo)未見明顯改變(P>0.05)。實驗后

9、，與WKY組相比，SHR組IVSTd及LVPWTd均明顯增加(P均<0.01)，RWT明顯增加(P<0.05)，E/A比值明顯減小(P<0.01)，E峰減速時間明顯延長(P<0.05)；與SHR組相比，非諾貝特組IVSTd及LVPWTd均明顯降低(P均<0.01)，RWT明顯降低(P<0.05)，E/A比值明顯增大(P<0.01)，E峰減速時間明顯縮短(P<0.05)。 IBS參數(shù)：實驗前，各組大鼠室間隔、左室后壁的IBS﹪和C

10、VIB無顯著差異(P>0.05)。實驗后，與WKY組相比，SHR組室間隔、左室后壁的IBS﹪明顯升高(P<0.01)，CVIB明顯降低(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組室間隔的IBS﹪明顯降低(P<0.05)，CVIB明顯升高(P<0.05)，左室后壁的IBS﹪明顯降低(P<0.01)，CVIB明顯升高(P<0.05)。 4.血流動力學(xué)檢測： 與WKY組相比，SHR組LVEDP明顯升高(P<0.01)，+dp/

11、dtmax、-dp/dtmax明顯下降(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組LVEDP明顯下降(P<0.01)，±dp/dtmax明顯升高(P<0.01)。 5.組織病理觀察HE染色切片上，WKY組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻；SHR組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，可見肌纖維斷裂、排列紊亂；非諾貝特組較SHR組明顯好轉(zhuǎn)，心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，肌纖維斷裂少見，細(xì)胞核較規(guī)則。 6.透射電鏡觀察超

12、微結(jié)構(gòu)的改變WKY組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，線粒體排列整齊，無腫脹變性，細(xì)胞間質(zhì)中可見成纖維細(xì)胞和少量膠原纖維，排列規(guī)整；SHR組線粒體腫脹，間質(zhì)中成纖維細(xì)胞、膠原纖維大量增生且排列紊亂；非諾貝特組總體較SHR組明顯好轉(zhuǎn)，線粒體排列整齊，間質(zhì)中成纖維細(xì)胞、膠原纖維明顯減少。 7．Masson染色膠原含量的檢測Masson染色顯示膠原纖維呈藍(lán)綠色，心肌纖維呈紅色。鏡下可見WKY組膠原組織分布均勻，排列整齊； SHR組心肌間質(zhì)膠原纖維明

13、顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維斷裂、排列紊亂；非諾貝特組較SHR組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少，相鄰細(xì)胞的膠原纖維排列整齊。 定量分析顯示：與WKY組相比，SHR組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)明顯升高(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組心肌CVF明顯降低(P<0.05)。 8．免疫組織化學(xué)染色分析C-Fos、C-Jun：染色陽性信號為棕黃色顆粒，主要是心肌細(xì)胞核表達(dá)。WKY組心肌細(xì)胞核著色弱且分布均勻；而SHR組心肌細(xì)

14、胞核著色分布廣且呈強陽性染色，C-Fos、C-Jun的核表達(dá)較wKY組明顯增2H(P<0.01)，非諾貝特組較SHR組核著色變?nèi)?，分布局限，C-Fos、C-Jun的核表達(dá)明顯減少(P<0.01)。 9．實時定量RT—PCR檢測各關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)PPARα mRNA表達(dá)：與WKY組相比，SHR組心肌PPARα mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，非諾貝特組心肌PPARα mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與SHR組相比，

15、非諾貝特組心肌PPARα mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，與WKY組相比，非諾貝特組心肌PPARα mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)。 C-Jun和C-Fos mRNA表達(dá)：與WKY組相比，SHR組心肌C-Jun和C-Fos mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)：與SHR組相比，非諾貝特組心肌C-Jun和C-Fos mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)。 MMP-9/TIMP-1 mRNA表達(dá)比值：與WKY組相

16、比，SHR組心肌MMP-9/TIMP-1比值明顯下降(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組心肌MMP-9/TIMP-1比值明顯升高(P<0.01)。 Collagen Ⅰ和CollagenⅢmRNA表達(dá)：與WKY組相比，SHR組及非諾貝特組心肌Collagen Ⅰ和CollagenⅢ mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組心肌Collagen Ⅰ和CollagenⅢ mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.

17、01)，與WKY組相比，非諾貝特組心肌Collagen Ⅰ和lCollagenⅢ mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)。10．Co-IP-Western blot檢測C-Fos/C-Jun異二聚體的形成與WKY組相比，SHR組心肌C-Fos/C-Jun異二聚體的形成明顯增多(P<0.01)；與SHR組相比，非諾貝特組心肌C-Fos/C-Jun異二聚體的形成明顯減少(P<0.01)。 結(jié)論: 1．16周齡SHR己出現(xiàn)明顯的